[发明专利]鉴定沙门氏菌属的特异性新分子靶标及其快速检测方法

说明书

本发明提供了一组用于检测沙门氏菌的分子靶标，所述分子靶标包括如SEQ ID NO.1～13所示的核苷酸序列。本发明还提供例了一组用于检测如权利要求1所述的用于检测沙门氏菌分子靶标的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO.14～39所示。采用本发明的引物针对特异性靶标进行PCR扩增，通过检测扩增产物是否含有目的条带判定样品中是否含有沙门氏菌，该方法降低了检测成本，更加具有实用性；本发明的特异性分子靶标即13个保守核酸具有单一的特异性，检测结果特异，结果判定简单。

技术领域

本发明属于微生物检验技术领域，涉及鉴别沙门氏菌属的特异性新分子靶 标及其快速检测方法。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的人畜共患病原菌，能够在人类、动物 及环境间传播，对人类和动物都具体极大的危害。人类感染沙门氏菌，除伤寒 和副伤寒是由水源传播以外，其它主要是由于食用了被污染的食品，特别是动 物性食品而导致的。在世界各地的食物中毒事件中，由其引起的食物中毒事件 常年居于前列，一般占总食物中毒的40％～60％，最高达90％。根据CDC的统 计，美国平均每年有120万人被沙门氏菌感染，造成2万多人住院治疗，引起 450人死亡。在我国，每年由沙门氏菌引起的食物中毒约占细菌性食物中毒事件 的40％，对人类健康构成很大的威胁。人体在感染沙门氏菌之后，可引发恶心、呕吐、腹泻、发烧等症状，若不及时治疗死亡率高达10％(Abdelhaseib等，2016)。 通常情况下沙门氏菌食用量超过10⁵CFU即可造成人类感染，而对于高度易感 人群15-20CFU即可引起沙门氏菌感染(Kokkinos等，2014)。

目前，沙门氏菌的检测主要利用国标规定的传统微生物培养方法(GB 4789.4-2016)，包括：预增菌培养、增菌培养、分离纯培养物、生化鉴定和血清 学鉴定等5个基本步骤。传统检测方法可重复性强，稳定性良好，是目前为止 可靠性最高的检测方法。但这种方法操作复杂繁琐，检测时间较长(5d以上)， 无法满足现场快速检测的需要。以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、 准确、简便的特点，逐渐成为取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一。

在PCR检测技术中，靶标序列和设计引物的特异性是关键。早在1992年， Rahn等利用鼠伤寒沙门氏菌的invA基因设计出了一对引物139-141，运用PCR 技术检测沙门氏菌属，特异的扩增片段为284bp(Rahn等，1992)。此后，agfA (Doran等，1993)、hin(Way等，1993)、H-li(Way等，1993)、IS200(Cano 等，1993)、riC(Fluit等，1993)、spvR(Mahon等，1993)、spvC(Rexach等， 1994)、fliC(Song等，1994)、viaB(Hashimoto等，1995)、stn(Prager等，1995)、 iagAB(Chevrier等，1995)、fimA(Cohen等，1996)、ompC(Kwang等，1996)、 iroB(Baumler等，1997)、hilA(Guo等，2000)、fimY(Yeh等，2002)、orgC (Day等，2003)、gyrB(Kakinuma等，2003)、c25(Chen等，2010)等基因 被陆续报道。研究表明，其中部分基因在极个别的沙门氏菌血清型中序列缺失， 且在检测非沙门氏菌时易产生假阳性结果(Malorny等，2003；Moore等，2007)。 因此，迫切需要系统性的挖掘特异性检测新靶标，从而为沙门氏菌的鉴定提供 快速、准确的方法。

本研究团队首次系统完成了我国43个主要城市4300份食品中致病微生物 风险调查，已分离保存了1500多株沙门氏菌，是目前我国食品源沙门氏菌最多 的菌种资源库，为本发明特异性新靶标的挖掘及验证，提供了强有力的保障。

经对现有技术的文献检索，尚未发现与本发明沙门氏菌13个特异性新分子 靶标及相应PCR检测方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供用于鉴别沙门氏菌 属的特异性新分子靶标及相应的PCR检测方法。