[发明专利]草本花卉的RNA原位杂交方法

权利要求书

1.一种草本花卉的RNA原位杂交方法，其特征在于，包括以下步骤：

固定：将取自花卉的材料浸入有FAA固定液的离心管中，抽气直至材料沉到离心管底部，4℃静置过夜；

脱水：将材料依次经体积百分比为50％、70％、80％、90％、95％、100％、100％和100％的乙醇脱水；

透明：将材料依次经体积百分比25％二甲苯/75％乙醇、50％二甲苯/50％乙醇、75％二甲苯/25％乙醇、100％二甲苯、100％二甲苯和100％二甲苯浸泡；

浸蜡：将材料转入陶瓷容器中，加入1/10二甲苯体积的氯仿，投入5～10片石蜡，室温静置过夜；将材料移到42℃温箱，使石蜡溶解，并逐步投放石蜡碎片，直到新投入的石蜡不再溶解；倒掉二甲苯和石蜡的混合物，加入熔解的石蜡，并置于60℃温箱中，之后早晚各换一次熔蜡，共换4次；

包埋：将新的熔蜡倒入叠制好的纸盒，用解剖针将材料挑入纸盒并摆正位置，浸入室温的水中，待石蜡完全凝固后得到样品，于4℃冰箱保存；

切片：将样品制成厚度为8～12μm的石蜡切片，37℃烘干至少12小时；

脱蜡和预处理：将石蜡切片依次通过以下各溶液进行处理，处理时间如下：

杂交：将6μl 10×杂交液hyb salt、30μl去离子甲酰胺、12μl 50％硫酸葡聚糖钠盐、2μl tRNA、和6μl 50×Denhardt's溶液混合并60℃保温，添加探针2μl和去离子甲酰胺2μl，85℃加热2分钟后迅速转移到冰上，得到杂交混合液；每一个切片上添加所述杂交混合液60μl，放置在含有2×SSC的保湿盒内密封放置在50℃培养箱内过夜；

检测：将切片洗涤后进行显色，然后终止反应在显微镜下镜检。

2.根据权利要求1所述的RNA原位杂交方法，其特征在于，所述10×杂交液hyb salt由NaCl、1M Tris-HCl、NaH₂PO₄·2H₂O、Na₂HPO₄·12H₂O和0.5M EDTA配制而成，且质量体积比为17.53g:10ml:7.8g:17.9g:10ml。

3.根据权利要求1所述的RNA原位杂交方法，其特征在于，所述50×Denhardt's溶液由Ficoll 400、PVP和BSA配制而成，且质量比为1:1:1。

4.根据权利要求1所述的RNA原位杂交方法，其特征在于，所述TEA/AA由2M TEA、Aceticanhydride和H₂O配制而成，且体积比为20:4:380。

5.根据权利要求4所述的RNA原位杂交方法，其特征在于，2M TEA的制备方法包括以下步骤：称取液体三乙醇胺149g，加入H₂O 400ml，然后用HCl调节pH值至8.0，再加H₂O至500ml。

6.根据权利要求1所述的RNA原位杂交方法，其特征在于，所述2×SSC由NaCl和柠檬酸钠配制而成，且质量比为17.53:8.82。

7.根据权利要求1所述的RNA原位杂交方法，其特征在于，所述FAA固定液含有以下体积百分比的组分：50％乙醇、5％冰醋酸、3.7％甲醛和余量的水。

8.根据权利要求1所述的RNA原位杂交方法，其特征在于，在所述脱水和所述透明的步骤中，每种溶液浸泡30min。