[发明专利]还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒及制备与应用

说明书

本发明提供了一种还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒的制备方法，具体方法如下：由小分子支化聚乙烯亚胺与硫化丙烯反应制得大分子二硫键改性的支化聚乙烯亚胺(SSBPEI)，使SSBPEI与siRNA通过静电结合制得SSBPEI@siRNA，以SSBPEI@siRNA为内核，在其表面通过静电结合修饰上聚乙二醇改性的聚谷氨酸(mPEG‑γ‑PGA)外壳，即得所述纳米粒。本发明的有益效果主要体现在：聚乙二醇的引入提高了载体的生物相容性和血液长循环能力；聚谷氨酸可以与肿瘤细胞上的肿瘤相关的γ‑谷氨酰转肽酶(GGT)特异性结合，使基因药物主动靶向递送至肿瘤部位；SSBPEI可在肿瘤细胞内的高浓度的谷胱甘肽还原下降解成低毒的小分子聚乙烯亚胺，降低大分子SSBPE毒性，同时可在肿瘤部位加速释放siRNA实现基因治疗。

(一)技术领域

本发明涉及一种还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒及其制备方法，以及其在制备肿瘤靶向基因药物中的应用。

(二)背景技术

基因治疗是指通过基因转移技术，将外源正常基因导入靶细胞，纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的的一种生物治疗方法。近年来，基因疗法已成为治疗各种疾病的重要的手段之一，特别是在肿瘤的治疗上。肿瘤基因治疗可以通过改变肿瘤细胞中基因的表达量，抑制肿瘤细胞的增殖生长等。但由于基因在肿瘤治疗过程中存在靶向性差，易被血清降解等缺点，基因载体成为基因治疗研究中的重要的一部分。

一个理想的基因载体需要具有高转染效率、肿瘤靶向性、低细胞毒性血液长循环能力等特点。目前，最常见的商用基因载体是支化聚乙烯亚胺，因其具有质子海绵效应，支化聚乙烯亚胺可很快从内涵体逃逸，从而在携带基因时，可得到较高的基因转染效率。大分子的聚乙烯亚胺具有高的基因转染效率，但细胞毒性大，低分子量的聚乙烯亚胺具有低毒性，但基因转染效率却很低。将低分子量的聚乙烯亚胺通过二硫键连接形成大分子的二硫键改性的聚乙烯亚胺，既可实现高基因转染效率，同时，由于二硫键改性的聚乙烯亚胺中的二硫键可被细胞内谷胱甘肽还原降解成低分子的聚乙烯亚胺，又能达到材料低毒性的目的。此外，由于肿瘤细胞中含有比正常组织要高出100～1000倍浓度的谷胱甘肽，二硫键改性的聚乙烯亚胺携带基因药物时则更容易被肿瘤细胞中的谷胱甘肽降解，释放出基因药物进行基因治疗，具有肿瘤靶向性。但是，二硫键改性的聚乙烯亚胺作为基因载体还远远不够，为了进一步使得基因载体具有血液长循环能力和主动靶向性，我们制备了聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒，由于聚谷氨酸(γ-PGA)可以与肿瘤细胞上的肿瘤相关的γ-谷氨酰转肽酶(GGT)特异性结合，因此纳米粒中γ-PGA的引入可将纳米粒更容易聚集在肿瘤部位，实现基因药物的肿瘤主动靶向递送。由于聚乙二醇具有良好的生物相容性和水溶性，聚乙二醇的引入使得纳米粒具有良好的血液长循环能力，实现基因药物的肿瘤被动靶向递送。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种具有低细胞毒性、较好的生物相容性，还原响应性的，能够有效结合基因并将其靶向递送至肿瘤细胞中的基因载体—聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒及其制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒，所述复合纳米粒由如下方法制备得到：先将低分子量的支化聚乙烯亚胺(BPEI)与硫化丙烯反应制得二硫键改性支化聚乙烯亚胺(SSBPEI)，再将SSBPEI与siRNA通过静电结合制得SSBPEI@siRNA内核，然后在SSBPEI@siRNA内核表面通过静电作用结合上聚乙二醇修饰的聚谷氨酸(mPEG-γ-PGA)外壳，即得所述纳米粒SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA。