[发明专利]用于表达甲状旁腺素PTH的融合蛋白及重组质粒、重组工程菌

说明书

本申请公开了一种用于表达重组甲状旁腺素PTH的融合蛋白，所述融合蛋白依次由表达增强肽、连接肽1、His6、连接肽2、引导蛋白、连接肽3、蛋白酶切位点和甲状旁腺素PTH(1‑34)组成；本发明还提供了用于表达重组甲状旁腺素PTH的融合蛋白的重组质粒及工程菌。通过本发明可以获得了以近似包涵体表达的融合蛋白及稳定的重组工程菌株。通过对表达蛋白进行蛋白酶酶切及少数步骤的纯化，可以获得纯度高于99.5％、具有良好生物学活性的目的蛋白PTH(1‑34)。

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，涉及甲状旁腺素PTH(1-34)的融合蛋白及表达载体。

背景技术

甲状旁腺素由甲状旁腺主细胞合成，含84个氨基酸。甲状旁腺素分泌入血以后，以三种形式存在。第1种，为完整的84个氨基酸(PTH(1-84))；第2种，含第1-34位氨基酸(PTH(1-34))；第3种，含第55-84位氨基酸。PTH(1-84)和PTH(1-34)均有通过骨骼和肾脏等靶器官调节机体血钙浓度的完全生物活性。PTH(1-34)包含了表现PTH全部生物活性的所有必需结构，具有完整PTH的生物学活性；而在促进成骨细胞生长、刺激骨形成方面更优于PTH(1-84)。

PTH(1-34)的制备，目前有化学合成及生物合成两种手段。化学合成相对容易，但要用到大量有机溶剂；同时PTH(1-34)在合成过程中需对关键氨基酸进行保护与去保护工作，最终成本并不低。因而，用重组大肠杆菌进行PTH(1-34)的生物合成是更优的解决方案。

在重组工程大肠杆菌表达中，常用引导蛋白帮助目的蛋白折叠、提高目的蛋白产量、可溶性及易于纯化等。PTH(1-34)以小分子多肽，单独表达难于纯化，一般都以融合蛋白表达的形式来进行。在表达过程中，融合蛋白以可溶形式表达并不利于PTH(1-34)，因其容易被氧化，通过后续纯化得到的被氧化的目的蛋白PTH(1-34)生活学活性大幅降低或丧失；而融合蛋白以形成致密包涵体形式表达，后续包涵体复性及目的蛋白纯化都很困难，尤其可能在PTH(1-34)纯化过程中用到反向层析纯化而使用大量有机溶剂，这将导致经济成本和环境成本的大幅上升。因此，寻找一种使PTH(1-34)在表达过程中不被氧化，在分离纯化过程中得率高、活性好且成本低的融合蛋白表达方法是制备PTH(1-34)的理想方案。

PTH(1-34)氨基端的完整性要求很高，添加、替换、删除原有氨基酸都不能保证其正常生物学活性，因此对融合蛋白中酶切位点的要求高。因子Xa识别位点Ile-Glu/Asp-Gly-Arg↓，肠激酶识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓，两者切割融合蛋白后不会在目的蛋白的氨基端留下多余氨基酸，但这两种酶都价格昂贵，也不容易自行制备。

发明内容

针对上述技术问题，发明人发现基于烟草花叶蚀刻病毒蛋白酶(TEV酶)识别一个七个氨基酸的序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly/Ser，切割发生在Gln和Gly/Ser之间，这样会使得目标蛋白的氨基端多一个Gly或Ser。而PTH(1-34)氨基端第一个氨基酸为丝氨酸(Ser)，因此，发明人决定用TEV蛋白酶酶切包含PTH(1-34)的融合蛋白是一个不错的选择。同时TEV酶可以用大肠杆菌表达，制备成本比肠激酶低。

本发明的一方面提供了一种用于表达重组甲状旁腺素PTH的融合蛋白，所述融合蛋白依次由表达增强肽、连接肽1、His6、连接肽2、引导蛋白、连接肽3、蛋白酶切位点和甲状旁腺素PTH(1-34)组成；其中，