[发明专利]一种快速培养肝芽类器官的方法

说明书

本发明公开了一种肝芽类器官的培养容器和培养方法，属于类器官培养领域。本发明的培养容器是内底表面带有肝脏细胞外基质印迹块阵列的细胞培养容器；所述底表面未覆盖纤连蛋白的区域被封闭剂封闭；单个所述印迹块的面积为225～625μm²。本发明的培养方法使用前述培养容器将间充质干细胞和脐静脉内皮细胞培养成细胞球，再收集细胞球与肝细胞共培养。本发明的方法方便快捷，成本低廉，能够得到在基因表达、代谢与肝脏接近的肝芽类器官。

技术领域

本发明属于类器官培养领域。

背景技术

类器官(Organoid)是一种在体外培育的具有来源器官显微解剖特征的多细胞三维结构，与体内的来源组织或器官高度相似，并能够表现出细胞与细胞、以及细胞与基质之间的相互作用，理想状态下，类器官与体内分化的组织具有相似的生理反应。类器官作为研究人类发育、构建疾病模型和药物筛选的工具，在脑，肠道，肝脏，前列腺和垂体等组织的研究中取得了显著进展^[1]。

而在肝脏类器官的研究方面，来自欧洲的Huch团队和来自日本的Takebe团队的工作最具代表性。

原代肝细胞，在体外无法扩增，对培养环境敏感，因此难以直接从原代干细胞培养出肝脏类器官。Huch团队将原代肝细胞通过添加其保密的生长因子配方和添加细胞外基质成分的培养体系筛选出Epcam⁺Lgr5⁺肝干细胞，并通过10天左右的培养和增殖分化，最终形成肝脏类器官^[2]，细胞量达到10⁷。

而Takebe团队通过进行大规模的“反向”筛选实验，最终确定将人iPS诱导的肝样细胞(iPSC-HEs)，与来自内胚层的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和间充质干细胞(MSCs)按一定比例混合后(10∶7∶2)在24孔板中共培养于商品化细胞外基质(Matrigel)上，在培养72h后，细胞自发卷积成团形成肝芽类器官(1iver bud organoids，LBOs)。与单一细胞形成的类器官相比，LBOs模拟了早期肝脏器官发育中自我凝集的过程，包括了细胞间的相互作用，细胞与胞外基质的相互作用，iPSC-HEs与非实质细胞(HUVECs和MSCs)的直接接触是LBOs形成所必需的。在LBOs形成过程中，MSCs和HUVECs产生的旁分泌的可溶性信号分子诱导iPSC-HEs向肝细胞分化，产生肝细胞功能和细胞极性。LBOs中肝特异性基因的表达明显高于单独的iPSC-HEs。通过对LBOs与胎儿和成人肝脏单细胞RNA测序数据进行比较，发现LBOs和胎肝细胞高度相似。LBOs在移植到SCID小鼠体内后进一步成熟，在移植15天后，人血清白蛋白，α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的分泌量都达到峰值，通过对LBOs肝脏代谢组学的分析，发现代谢谱与人成体肝相似^[3]。将肝芽类器官移植到患有重度肝衰竭的免疫缺陷小鼠后，小鼠生存率会获得大幅提高。

通过比较Huch团队和Takebe团队的工作，可以看出HUVECs与MSCs均是容易获得和培养的细胞，LBOs方式更适合原代肝细胞的培养。