[发明专利]杏褪绿卷叶植原体新疆分离物LAMP快速检测方法

权利要求书

1.杏褪绿卷叶植原体新疆分离物LAMP检测方法，其特征在于，具体检测步骤如下：

（1）设计并提供1套用于检测杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的LAMP引物：在Genebank中搜集全部植原体的tuf基因核苷酸序列，利用Omiga软件对上述序列进行比较及一致性分析，找出杏褪绿卷叶植原体新疆分离物与其他植原体的基因差异位点和高度保守区域，利用LAMP引物在线设计软件Primer Explorer V4针对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物tuf基因保守序列的6个区域设计出1套特异性引物，包括1对外引物和1对内引物，即长度分别为23bp、21bp、44bp和43bp的寡聚核苷酸序列，依次命名为ACLR-F3、ACLR-B3、ACLR-FIP和ACLR-BIP，上述两对LAMP引物的寡聚核苷酸序列如下：

ACLR-F3：5'-AGAACGTGGTATTACAATTAACG-3'；

ACLR-B3：5'-AGGAACTCCTACTTGTTTAGC-3'；

ACLR-FIP:5'-TGCCCAGGACAATCTATGTGACTTCGCACATAGAATATCAAACG -3'；

ACLR-BIP:5'-AAGAACATGATCACAGGAGCTGCTTTGAGGCATTACTCCATCT-3'；

（2）模板的提取：采用植物基因组提取试剂盒：Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN，提取提取杏树枝条韧皮部或叶脉总DNA作为模板；

（3）配制LAMP反应体系：反应体系为25µL，所述的LAMP反应体系为：8 U/µL Bst2.0WarmStart^® DNA聚合酶0.5 µL；1xThermoPol反应缓冲液2.5 µL；10 mmol/L dNTPs 2.5 µL， 10 mmol/L Betaine 2.0 µL；100 mmol/L MgSO₄ 1.5 µL，20 µmol/L内引物ACLR-FIP/ACLR-BIP各1.5 µL，10 µmol/L外引物ACLR-F3/ ACLR-B3各0.5 µL，1.25 mmol/L钙黄绿素1.0 µL；12.5 mmol/L MnCl₂ 1.0 µL，模板DNA 1.0 µL，补足灭菌超纯水至25 µL；

（4）通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增，所述的LAMP反应程序：将混合物置于61℃恒温反应 60 min，80 ℃灭活 5 min；

（5）LAMP反应结果分析：分析方法1：琼脂糖凝胶电泳，反应结果通过2%的琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色15 min后，在凝胶成像系统上成像，若出现梯形条带判定为阳性，反之，为阴性；分析方法2：肉眼观察反应管中颜色的变化，若扩增产物变为翠绿色则判定为阳性反应，即样品中感染有杏褪绿卷叶植原体新疆分离物，若扩增产物仍为棕黄色则判定为阴性。