[发明专利]耐高温D-阿洛酮糖3-差向异构酶、突变体及其应用

说明书

本发明涉及一种新型耐高温D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶及突变体，及其在微生物催化D‑果糖异构化制备D‑阿洛酮糖(D‑psicose)中的应用。所属异构酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述异构酶突变体由SEQ ID NO.3所示氨基酸经定点突变而得，所述点突变位点为下列中的一个或多个：(1)第106位、(2)第183位、(3)第211位、(4)第276位。本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种全新的耐高温D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶突变体，该突变体具有超高酶活和底物转化率，最适反应温度可达90℃。当底物浓度为700g/L，反应温度为85℃时，产物得率最高达67.14％。将重组酶进行固定化并连续催化300批次，转化率均大于67％。本发明解决了现有酶催化制备D‑psicose效率低下的难题，获得的优于文献报道的连续转化效果对提升D‑psicose工业化水平具有重要意义。

(一)技术领域

本发明涉及一种耐高温D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其突变体，及其在微生物催化D-果糖异构化制备D-阿洛酮糖中的应用。

(二)背景技术

D-阿洛酮糖(D-psicose)是D-果糖的C-3差向异构体，属于稀有糖家族，因其高甜度低能量，是一种理想的蔗糖替代物。D-psicose通过竞争吸收和排泄转运糖蛋白，可以抑制D-果糖和D-葡萄糖的吸收，进而减少体内脂肪累积，降低糖尿病风险。长期和短期的D-psicose膳食补充，对II型糖尿病患者和胰岛β-细胞功能缺陷患者细胞均有明显的益处。D-psicose在自然界中含量稀少，仅在部分植物(如小麦和鼠刺属植物)中有发现，直接提取导致资源浪费和环境破坏。采用化学合成法，催化反应复杂，纯化过程繁琐，化学污染严重。因此，需要采用更加高效的合成方式制备D-psicose。

生物转化是一种利用微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂，将底物转化为产物的过程。生物转化具有反应条件温和、原料利用率高的特点，同时转化过程具有优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性，能够保证目标化合物的高效合成。目前，利用异构酶或含有该酶的细胞为生物催化剂进行异构化反应制备多种糖类化合物，已成为制糖工业重要的经济增长点。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose3-epimerase，简称DPE)属于酮糖3-差向异构酶家族，用于催化D-果糖异构化生成D-psicose。当前的D-psicose生产技术主要集中在日本稀有糖研究中心、首尔国立大学等机构，所用的DPE主要来源于Agrobacteriumtumefaciens ATCC33970、Clostridium cellulolyticum H10和Rhodobacter sphaeroidesSK011等野生菌(Kim T et al.，PLoS ONE,2016,11(7):e0160044.)。上述DPE均不属于耐热性酶，只能在50～60℃的异构化温度下进行催化反应，D-果糖转化率介于25～35％之间。

有报道指出，DPE介入的D-果糖异构化过程是一个热力学平衡反应，随着异构化温度的升高，会促进异构化反应向D-psicose方向进行。如果能在高温如70℃或更高的异构化温度下催化，促使平衡正向进行，提高D-果糖转化率，获得高浓度产物，将大幅度减小生产、提取等成本。目前，用于合成的D-psicose的DPE酶源较少，工业化水平有待提高。

由于异构酶本身作用环境和对象的多样化，通常具备底物谱广泛的优势，可以由一种异构酶催化制备多种糖产品。酶的分子改造能通过分子手段极大限度地提高天然酶的催化效率，是改造天然酶的重要手段。本发明通过探索异构酶的底物谱，开发异构酶的新功能，将分子改造获得的高效生物催化剂用于制备高浓度D-psicose，对于满足人民群众日益增长的摄糖需求具有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种耐高温D-阿洛酮糖3-差向异构酶及突变体，及其在微生物催化D-果糖异构化制备D-阿洛酮糖中的应用。

本发明采用的技术方案是：