[发明专利]一种具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白及其表达方法

说明书

本发明涉及一种具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白及其原核表达方法，所述的人源III型胶原蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示，通过与基因序列为SEQ ID NO:4的羟化酶Hy726共同表达，得到具有三级螺旋结构的重组人源III型胶原蛋白，该蛋白具有更好的稳定性和功能性，更能媲美天然人源III型胶原蛋白生物活性。

技术领域

本发明属于优化编码基因技术领域，具体地涉及一种具有功能结构重组人源III型胶原蛋白及其原核表达方法。

背景技术

体胶原蛋白又称胶原，是一种糖蛋白，III型胶原蛋白由三条肽链向右卷曲扭成的三股螺旋状。一级结构分析表明，其多肽链很长的区段序列是由GLy-x-y氨基酸序列重复而成。其中，x通常为脯氨酸，y通常为羟脯氨酸和羟赖氨酸，这种三肽重复序列对胶原蛋白的结构起着很大的作用，特别是成纤维胶原的胶原域是由长而不中断的三股螺旋组成。羟脯氨酸和羟赖氨酸在其他蛋白质中很少见，羟脯氨酸羟基能参与链间的氢键形成，促进三螺旋结构的形成，提高胶原蛋白的稳定性和功能性，对稳定胶原蛋白三螺旋结构并保证其在体温下的热稳定性至关重要。

胶原蛋白现已被广泛应用于化妆品、医疗器械等领域，用于实现对组织的修复、再生。胶原蛋白的三股螺旋结构对于其实现组织修复功能起着至关重要的作用，同时三股螺旋结构的胶原蛋白比单链的多肽序列要稳定。传统的胶原蛋白主要通过提取的方式从动物组织中获得。然而，动物组织中提取的胶原蛋白存在感染疯牛病等传染性病毒的风险。

现有技术中，虽然对III型人源胶原蛋白的重组技术进行了一些报道，例如CN110194795A公开了一种重组人源胶原蛋白及其应用，选取了人源三型蛋白保守区域的一段序列并将其重复8次，将设计得到的序列重组构建原核表达载体pET22b中，经过诱导表达，最终得到了能够在大肠杆菌中高效表达的，可溶于水的重组人源胶原蛋白。CN103122027A公开了一种重组人源胶原蛋白及其生产方法，结构为单链结构，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，末端序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段。尚未有对于重组人源胶原蛋白的功能性三维螺旋结构的技术报道。

有鉴于此，发明一种具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白的表达方法尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够提高稳定性的具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白，并同时提供其高效的原核表达方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明一方面提供了一种具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白，其具有三级结构，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了一种参与上述胶原蛋白表达的羟化酶Hy726基因，其核苷酸序列为为SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供了一种包含所述人源III型胶原蛋白的编码基因和羟化酶Hy726基因的重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230。

本发明还提供了一种含有所述重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明最后一方面提供了一种所述具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白原核表达方法，具体包括如下步骤：

（1）基因设计和合成

依据人源III型胶原蛋白氨基酸序列SEQ ID NO:1和巨型病毒 4-脯氨酸羟化酶氨基酸序列SEQ ID NO:2，反向设计基因序列，进行密码子优化，得到人源III型胶原蛋白的编码基因序列SEQ ID NO:3和羟化酶Hy726基因序列SEQ ID NO:4，进而根据SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示基因序列，分别进行全基因合成；