[发明专利]一种多片段DNA组装试剂盒、多片段DNA组装方法及其应用

说明书

本发明提供了一种多片段DNA组装试剂盒、多片段DNA组装方法及其应用，所述试剂盒包括待组装的DNA片段F_n和载体；所述载体包括中间连接载体和/或组装载体；所述试剂盒还包括酿酒酵母菌。本发明采用体外组装和体内组装相结合的方式，首先通过PCR合成初始片段并加入中间连接载体中，随后采用重组酶体系将大片段DNA与组装载体在体外进行组装，再将体外组装产物转化入酿酒酵母菌进行体内组装，结合了体外组装和体内组装的优点，显著提高了超大质粒的合成成功率。

技术领域

本发明属于合成生物学技术领域，涉及一种多片段DNA组装试剂盒、多片段DNA组装方法及其应用，尤其涉及一种多片段DNA组装试剂盒、多片段DNA组装方法及其在构建大片段重组质粒中的应用。

背景技术

近年来合成生物学迅速发展，在生物医药、能源和新材料等领域得到广泛的应用。超大质粒可以服务于大型代谢通路研究、染色体研究和基因组研究等，有助于进行基因功能、代谢通路功能研究和认识生命。但是，超大质粒的合成存在诸多困难，科学家们虽然提出了多种方法用于超大质粒的合成，但是普遍存在效率低下的问题。这就需要在超大质粒的合成和拼装技术上进行改进和突破。

现阶段，体外大片段组装方法包括Gateway、In-fusion、Cold-fusion、T4 DNApolymerase-based Ligase Independent Cloning(LIC)、Golden Gate和Gibson Assembly等。其中，Gateway技术需要构建入门载体，耗时较长，成本较高；Golden Gate技术依赖于II型限制性内切酶和连接酶，不适用于存在上述酶的序列的合成，需要提前分析片段序列再进行组装；而传统的Gibson组装技术在进行多片段组装时效率较低，尤其是对于片段较大的片段，组装成功率很低。

因此，需要提出新的高效的超大质粒组装方法。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种多片段DNA组装试剂盒、多片段DNA组装方法及其应用，所述试剂盒将体外组装和体内组装相结合，显著提高了多片段DNA组装效率，提高了超大质粒的合成成功率。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种多片段DNA组装试剂盒，所述试剂盒包括待组装的DNA片段F_n和载体；

所述载体包括中间连接载体和/或组装载体；

所述DNA片段F₁的上游和DNA片段F_n的下游包含中间连接载体的同源臂，即与中间连接载体的两端具有相同的重叠序列；

所述DNA片段F_i的上游与DNA片段F_i-1的下游具有一段重叠的反向互补序列，所述DNA片段F_i的下游与DNA片段F_i+1的上游具有一段重叠的反向互补序列；

其中，n≥2且为偶数，1≤i≤n；

当i为奇数时，所述片段F_i为正向序列，当i为偶数时，所述片段F_i为反向互补序列；

所述试剂盒还包括酿酒酵母菌。

本发明中，所述试剂盒采用体外组装和体内组装相结合的方式，首先采用重组酶体系将大片段DNA与组装载体在体外进行组装，再将体外组装产物转化入酿酒酵母菌进行体内组装，所述试剂盒结合了体外组装和体内组装的优点，解决了单纯采用体外组装或体内组装构建超大质粒成功率低的问题。