[发明专利]一种溶菌酶亲和填料制备及应用方法

说明书

本发明公开了一种溶菌酶亲和填料的制备及应用方法，通过与固相载体表面的羟基、羧基、氨基或环氧基键合，将溶菌酶固定在固相载体上即得溶菌酶亲和填料，使用该亲和溶菌酶填料分离溶菌酶抗体融合蛋白、微生物代谢产物等其它途径分离得到的溶菌酶抗体，分离效率高，得到的溶菌酶抗体纯度高达95%以上。

技术领域

本发明属于生物技术制药工程技术领域，具体涉及一种溶菌酶亲和填料制备及应用方法。

背景技术

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌破裂。溶菌酶还可与带负电的病毒直接结合，与DNA、RNA、脱辐基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

溶菌酶是多种动物组织的内源性免疫系统的重要组成部分，不同的组织，其正常含量也各不相同；不少组织中的溶菌酶含量的变化通常会与某些疾病相关联。例如，血液的尿液中溶菌酶浓度异常意味着血液或肾脏方面的疾病；新生儿体内溶菌酶缺乏可能会导致支气管性肺发育障碍；食谱中溶菌酶缺乏可能会增加患痢疾病的发生。因此，对体内溶菌酶的检测在对很多疾病诊断中起着非常重要的作用。

目前国内溶菌酶检测主要黄色微球菌比浊法、平板扩散法、电致化学发光法等，上述方法都普遍存在特异性、重复性或准确性差等方面的不足。随着免疫学技术的广泛应用，重组抗体在检测领域也更多地被采用；与传统的多克隆抗体相比较，重组抗体具有其独特的优势，可在原核表达体系里表达，周期极短、生产量大且成本低，对日益增长的大规模检测和生产有重要意义。

目前溶菌酶抗体常用的分离方法有结晶法、沉淀法、离子交换法、亲和层析法等，其中亲和层析技术具有高收率、高纯度、能保持生物大分子天然状态等优点，常规重组抗体的分离可采用蛋白A、蛋白G等亲和填料，如专利CN109336968A公开了一种蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法，循环利用以下蛋白A亲和层析柱纯化目标抗体：填料为MabSelect LX、Amsphere A3或Praesto Jetted A50，柱高为5～15cm，线性流速为200～500cm/h；在用洗脱液洗脱目标抗体之前，先用pH值为5～6，电导率为20～100mS/cm的缓冲液洗涤柱床，该专利通过选用载量高、传质能力好、运行流速快的填料，既降低了介质成本，又提高了纯化效率；但将该方法主要通过与抗体Fc片段结合纯化，对于单链抗体或者纳米抗体等无Fc片段等抗体无法进行分离纯化。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明提出一种溶菌酶亲和填料制备及应用方法，通过将溶菌酶键合到固相载体上，制备出高亲和溶菌酶抗体的填料，使用该亲和溶菌酶填料分离溶菌酶抗体融合蛋白、微生物代谢产物等其它途径分离得到的溶菌酶抗体，分离效率高，得到的溶菌酶抗体纯度高达95%以上。

本发明所提供的技术方案如下：

一种溶菌酶亲和填料的制备方法，通过与固相载体表面的羟基、羧基、氨基或环氧基键合，将溶菌酶固定在固相载体上即得溶菌酶亲和填料。

优选地，所述固相载体为聚合物微球、琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、聚碳酸脂、消化纤维、二氧化硅或磁性微球等。

优选地，溶菌酶亲和填料的具体制备步骤如下；

（1）填料活化：将固相载体溶液的PH调至13~14，加入活化剂和还原剂进行反应，结束后用去离子水清洗；

（2）配体偶联：向步骤（1）反应后的体系中加入溶菌酶和无游离氨基的偶联缓冲液，调节其pH为8~10后进行反应，结束后用去离子水清洗；

（3）封闭反应：向步骤（2）反应后的体系中加入封闭剂，调节其pH为8~9后进行反应，结束后用去离子水清洗，即得溶菌酶亲和填料。