[发明专利]一种RNA放大检测方法及检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种RNA放大检测方法及检测试剂盒，属于生物技术方法领域。检测方法包括RNA试样制备，向RNA试样中加入核酸提取液进行核酸提取获得待测样品RNA，向待测样品RNA中分步加入第一步反应液、酶液和第二步反应液等步骤，即可定量或定性检测待测样品RNA，还公开了用于RNA定量和定性检测的RNA放大检测试剂盒。本发明提供的方法和试剂盒具有体系兼容性好、扩增效率高、检测灵敏度高、准确度高、检测速度快的优点，适用于临床检验、血液筛查、食品安全检查及环境监测等领域中的核酸检验。

技术领域

本发明属于生物技术方法领域，具体涉及一种RNA放大检测方法及检测试剂盒。

背景技术

RNA包括mRNA、miRNA、rRNA、tRNA，都参与了基因表达、基因调控和代谢调控等。有着生命活动的生物内都会有大量的RNA，因此，RNA也是活体细胞、细菌等的标志。RNA在细胞、细菌等生命体内的拷贝数远高于DNA的拷贝数，且某些RNA具有高度保守性可以作为物种鉴定标识物，因此RNA可用于物种的鉴别诊断，提高检测灵敏度。另外随着生命科学的发展，发现大量的RNA参与疾病的发生、发展及调控，因此RNA又成为新的疾病诊断、疗效监测及预测的分子标识。

RNA具有稳定性差，易降解的普遍特点，部分小RNA还具有片段短，样本制备难度大的缺点，导致RNA检测很困难。为解决这些难题，近年来已经建立了多种RNA检测方法。

Northern Blots是最早建立的RNA检测方法。其主要原理是利用标记的寡核苷酸探针与结合在硝酸纤维素膜上的目标RNA互补杂交，然后显影检测。这种方法一直被认为是标准方法，但是存在费时费力、灵敏度低，样品量大、效率低等缺点。

逆转录-定量PCR(RT-qPCR)是目前检测低表达水平RNA的主要方法之一。该方法首先将RNA反转录成相应的cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR。但由于RNA易降解的特点，仍存在提取纯化RNA过程复杂，操作要求高，灵敏度低，繁琐耗时长的问题，限制了其临床应用。现有技术中已经建立的多种RNA检测方法均存在诸多缺陷。并且，当病原体存在多种亚型或者是需要同时联检多种相关病原体时，使用现有技术方法存在一个反应系统中多对引物会对体系产生抑制作用，影响扩增效率等问题，制约了检测效率的提高，因此这种复杂的体系的灵敏度往往很难提高。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种RNA放大检测方法，包括以下步骤：

1)将含有待测样品RNA、引物、探针、荧光探针和相关聚合酶的反应物混合为反应混合物；

2)将反应混合物置于密闭容器中进行恒温放大反应，并用检测仪同步检测反应体系中荧光信号的变化，定量或定性检测待测样品RNA。

上述反应混合物包含以下组分：

a.待测样品RNA；

b.第一引物：所述第一引物的序列包含启动子序列和共同引物序列，其中所述共同引物序列为与所述待测样品RNA非同源的序列；可选的，所述启动子序列为T7启动子序列，所述T7启动子序列的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:33所示；可选的，所述第一引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示；

c.探针A：所述探针A的3’端序列为与待测样品RNA特异性结合的序列，5’端序列为所述第一引物的序列；

d.探针B：作为第二引物，其序列与所述待测样品RNA序列一致；

e.荧光探针，用于与所述恒温放大反应产物结合；

f.逆转录酶；和

g.识别所述启动子序列的RNA聚合酶；

优选的，还包含：