[发明专利]一种四环素类抗生素降解菌及其在土壤污染修复中的应用

权利要求书

1.一种四环素类抗生素降解菌，其特征在所述降解菌为硝化还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens。

2.根据权利要求1所述的一种四环素类抗生素降解菌，其特征在于所述降解菌菌株通过以下步骤得到：

(1)四环素类抗生素耐受菌的筛选、驯化：用土霉素初始浓度10mg/L的筛选培养基从猪粪样品的菌悬液中筛选菌种，并以土霉素浓度依次是10mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L的筛选培养基每个浓度转接6次，富集培养驯化获得耐受菌株；

(2)四环素类抗生素降解菌的分离和纯化：将驯化获得的耐受菌株制成耐受菌培养液，用无菌水分别稀释至10^-4、10^-5、10^-6和10^-7的稀释液，然后分别采用平板涂布法和平板划线法进行菌株的分离与纯化获得单一菌株；

(3)将分离纯化的每一单一菌株接种到含四环素类抗生素唯一碳源的无机盐培养基中进行降解实验筛选获得对无机盐培养基中四环素类抗生素降解能力最强的菌株，鉴定为硝化还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens，简称硝化还原假单胞菌PN1。

3.根据权利要求1所述的一种四环素类抗生素降解菌，其特征在于所述的四环素类抗生素为土霉素和四环素中的一种。

4.一种权利要求1-3中任一项所述四环素类抗生素降解菌在土壤污染修复中的应用，其特征在于以菌悬液和固定化菌剂形式应用。

5.根据权利要求4所述四环素类抗生素降解菌在土壤污染修复中的应用，其特征在于所述的菌悬液通过以下方法制备：

将硝化还原假单胞菌PN1活化后，接种于固体培养基中，并于28℃的恒温恒湿培养箱培养48h至微生物的生物量达到最大，然后用无菌生理盐水将细菌冲洗下来配制成OD600为0.5±0.01的菌悬液。

6.根据权利要求5所述四环素类抗生素降解菌在土壤污染修复中的应用，其特征在于所述的固定化微生物菌剂通过以下方法制备：

将已洗净烘干磨碎的固定化载体灭菌处理后加入无菌无机盐液体培养液，再加入硝化还原假单胞菌PN1的菌悬液作为接种液接种，混匀密封后于28℃恒温恒湿培养箱培养至生物量最大而制得固定化微生物菌剂。

7.根据权利要求6所述的四环素类抗生素降解菌在土壤污染修复中的应用，其特征在于所述的固定化载体为甘蔗渣、花生壳和稻草杆中的一种或几种。

8.根据权利要求6所述的四环素类抗生素降解菌在土壤污染修复中的应用，其特征在于所述固定化载体为甘蔗渣时，所述无机盐液体培养液与处理过的甘蔗渣的用量比为7.5mL：1g。

9.根据权利要求8所述的四环素类抗生素降解菌在土壤污染修复中的应用，其特征在于所述接种液OD600为0.5±0.01，所述接种液与处理过的甘蔗渣的用量比为3.5mL：1g。

10.根据权利要求6所述的四环素类抗生素降解菌在土壤污染修复中的应用，其特征在于所述微生物菌剂的用量为以蔗渣载体1重量份处理其10倍重量份的污染土壤。