[发明专利]一种适用于oligodT富集的mRNA二代测序结果分析方法

说明书

本发明公开了一种适用于oligodT富集的mRNA二代测序结果分析方法，其特征在于，包括测序数据过滤步骤、测序数据比对步骤、样品表达量计算步骤、差异分析步骤、富集分析步骤、外显子差异分析步骤、可变剪切分析步骤、序列差异分析步骤和转录本序列制备步骤。本发明的方法更加快速和适用于ligodT富集的mRNA二代测序。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种适用于oligodT富集的mRNA二代测序结果分析方法。

背景技术

转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。真核生物的蛋白编码基因在3’末端有一段poly(A)尾，所以对于真核生物，提取总RNA后，可以用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，打断成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，制备RNASeq文库，构建好的文库用Illumina测序仪进行测序。

测序后的数据需要进行生物信息学分析，获取样品的基因表达信息，推断生物学意义。通常一个样品可以获得数千万个测序reads，之前的分析方法存在计算机资源消耗大、运行时间慢等缺点。同时，不断的出现新的分析方法和软件，现有的mRNA分析流程需要优化和补充。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种适用于oligodT富集的mRNA二代测序结果分析方法。

为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：

一种适用于oligodT富集的mRNA二代测序结果分析方法，包括如下步骤：

步骤一，测序数据过滤步骤：

使用fastp软件去除测序结果中的接头和低质量序列：

fastp使用PE reads overlap信息自动识别接头序列，具体是：

同时以5个碱基长度为窗口，从3’端向5’端滑动，截去窗口内平均质量小于20的窗口。最后保留长度大于50的reads；

将去除接头和低质量序列后的测序数据采用fastqc软件进行质量控制：

所述质量控制为根据RNASeq的测序特点提供质量控制标准；

步骤二，测序数据比对步骤：

使用hisat2软件将过滤后的数据与参考基因组进行比对：

首先从基因组数据库中下载对应物种的参考基因组，下载下来的基因组序列使用hisat2-build构建索引；

对于构建索引后的序列进行比对；

将比对完成的测序数据通过RSeQC进行质量控制；

将比对完成的测序数据通过RSeQC进行质量控制：

所述RSeQC的质量控制为，所述RSeQC结果的reads分布在基因间区上呈现出中间高，两端低的分布形状；

步骤三，样品表达量计算步骤：

使用htseq计算样品的表达量，具体计算为：

Htseq结合测序reads在基因组上的比对结果和基因在基因组上的位置，将reads分配到各个基因上。首先需要给比对的结果进行排序，运行htseq的时候需要指定文库的链特异性信息-s yes/reverse/no。htseq默认只保留唯一比对或只有对应一个基因的reads，判断可能属于多个基因的reads将被舍弃；

步骤四，差异分析步骤：