[发明专利]一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法

说明书

本发明公开了一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，包括一系列的测序数据过滤步骤、测序数据比对步骤、环状RNA连接点鉴定步骤、差异分析步骤、基因注释步骤和富集分析步骤来进行。本发明的分析方法可以帮助发现新的circRNA信息，进一步对环状RNA鉴定和表达定量分析。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法。

背景技术

circRNA(circular RNA，环状RNA)是一类具有闭合环状结构的非编码RNA分子，没有5′帽子结构和3′poly(A)结构，主要位于细胞质或储存于外泌体中，不受RNA外切酶影响，表达更稳定且不易降解，已被证明广泛存在于多种真核生物体内。大多数circRNA是由外显子环化而成，也有部分circRNA是由内含子环化而成的套索结构(lariat)。同时由于circRNA含有大量的miRNA应答原件(MREs)，能与AGO蛋白形成RNA诱导沉默复合体(RISC)的催化核心，最终导致circRNA降解。根据来源，circRNA可大致分为四类：全外显子型的circRNA，内含子和外显子组合的EIcircRNA，内含子组成的套索型ciRNA，由病毒RNA基因组、tRNA、rRNA、snRNA等环化产生的circRNA。

现有的基于芯片的circRNA分析方法，依赖于已知的circRNA信息，无法发现新的circRNA。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法，所述方法适用于去除rRNA并且链特异性建库，或者去除线性RNA的RNASeq测序结果分析。

为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：

一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法，包括如下步骤：

步骤一，测序数据过滤步骤：

使用fastp软件去除测序结果中的接头和低质量序列：

fastp使用PE reads overlap信息自动识别接头序列，具体是：

同时以5个碱基长度为窗口，从3’端向5’端滑动，截去窗口内平均质量小于20的窗口。最后保留长度大于50的reads；

将去除接头和低质量序列后的测序数据采用fastqc软件进行质量控制。

步骤二，测序数据比对步骤：

首先从基因组数据库中下载对应物种的参考基因组，下载下来的基因组序列使用hisat2-build构建索引；

对于构建索引后的序列进行比对；

将比对完成的测序数据通过RSeQC进行质量控制；

步骤三，环状RNA连接点鉴定步骤：

对于比对不上基因组的序列，使用find_circ进行环状RNA连接点鉴定，所述的环状RNA连接点鉴定具体是：

先对于hisat2比对结果进行筛选，挑选没有比对结果和比对结果中出现大片段(10bp)soft-clip的reads进行二次比对；

接着挑选出的reads从两端分别截取20bp，使用bowtie2与基因组比对；如果两个序列比对的位置是相反的，这条Reads就可能来自一个CircRNA；

接着需要对这个CircRNA进行二次判断：

将Anchor序列一直延伸，如果到连接点处为止序列都能够与参考基因组完全匹配，并且连接点处的剪切模式符合AG-GT的剪切模式，就认定这是一个CircRNA；

步骤四，差异分析步骤：