[发明专利]等位基因核酸富集和检测方法

说明书

本发明提供一种富集核酸延伸产物的方法，包括a.对样品中包含一组或多组等位基因对的核酸进行富集，所述富集的产物至少5kb，优选至少8kb，更优选至少10kb，并且富集的产物包含至少一组等位基因对；b.在探针与核酸杂交的条件下将探针与含有核酸的样品接触，所述探针包括分别靶向所述至少一组等位基因对中任一组的两条等位基因的至少两种探针，并且靶向其中一条等位基因的探针的延伸受到抑制，c.延伸探针，和d.富集延伸产物。

技术领域

本发明属于核酸富集领域，具体涉及利用核酸的杂交和延伸而富集和检测等位基因的方法。

背景技术

生物单倍体、二倍体和多倍体生物。包括人在内的许多物种都是二倍体生物，即含有两组染色体，单组染色体即为单倍体。在单倍体中，紧密连锁的多个等位基因的线性组合，每种组合方式即为一种单倍型。单倍型可以由多个SNP位点构成，包含丰富的遗传信息，研究单倍型比单个SNP位点具有更好的分析效果，更能有效反映出疾病的遗传机制，其在遗传病检测领域有着越来越广泛的需求。

遗传信息的变异是所有基因组的共同特征，而单碱基对的差异，也称单核苷酸多态性(SNP)是变异中最常见的一种形式，占所有已知多态性的90％以上。SNP位点并不是独立遗传的，而是在染色体上成组地遗传。一般来说，一个SNP位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据，因此被广泛用于群体遗传学研究和疾病相关基因的研究，在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。

基因分型(Phasing)还称为基因定相、单倍体分型或单倍体构建。基因分型是指把二倍体(甚至是多倍体)基因组上的等位基因(包括杂合位点，例如SNP)，按照其亲本正确地定位到父亲或者母亲的染色体上，最终使得所有来自同一个亲本的等位基因都能够排列在同一条染色体里。

现有的NGS测序技术，都是把序列打乱混在一起测序。这种方法无法直接区分这些序列中哪一个是父源，哪一个是母源的。通常只能检测出基因组上有哪些变异，以及这些变异的碱基组成(纯合、杂合)，也就是平时所说的基因型。只有经过基因分型，才能够实现这个基因型的区分。

基因分型在遗传学研究中应用广泛。例如，人群基因分型后形成的单倍型参考序列集是基因型推断必须的数据材料。而基因型推断是基因型-表型关联分析研究中必不可少的环节。高质量的参考序列集能提升关联分析的统计功效，而对被研究的对象进行基因分型也可以极大地提高基因型推断的准确性。还例如，用多个位点组成的单倍型组，而不是简单的单位点基因型，可实现群体遗传历史的研究。此外，通过基因分型的家系人群单倍型序列，可以计算染色体重组率、重组热点等重要遗传参数。基因分型还可用于探测频发突变、选择信号以及基因表达的顺势调控。

SNP作为最常见也是最稳定的一种人类可遗传变异，可靠的SNP分析检测对于疾病的预防与诊断以及实现个性化医疗等均具有重要意义。目前对SNP检测的检测方法有很多。TaqMan探针法针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针，利用荧光基团和淬灭荧光基团进行实时荧光PCR扩增；SNaPshot法是由美国应用生物公司(ABI)开发的基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序；高分辨率熔解曲线分析(HRM)通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，判断是否存在SNP。MassArray法通过引物延伸或切割反应与MALDI-TOF-MS技术相结合，实现基因分型检测；均相无标记的SNP基因分型技术(Hong-Qi Wang等，Analytical Chemistry,2011,83,1883-1889)基于连接酶介导的链置换放大技术以及DNA酶催化的化学发光反应；以及基于二代测序的目标区域捕获技术(多重PCR和探针捕获)。这些技术在检测单倍型方面有两个缺陷。