[发明专利]一种仅基于化学试剂的新型基因克隆方法

权利要求书

1.一种仅基于化学试剂的新型基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：

(1)用硫代修饰引物扩增目标基因和质粒载体，其中引物序列的特征为：(a)5’端第1-25位间的磷酸二酯键为间隔性硫代修饰，相邻硫代修饰间相隔3-10碱基；(b)扩增目标基因和质粒载体的正向引物的5’端第1-25位间的碱基序列彼此互补配对，扩增目标基因和质粒载体的反向引物的5’端第1-25位碱基序列彼此互补配对；(c)3’端下游18-25个碱基序列与待扩增的目标基因和质粒载体的DNA片段两端碱基序列配对；

(2)将目标基因扩增产物和质粒载体扩增产物进行碘酒热处理，在目标基因和线性化载体的硫代修饰处断裂DNA中的磷酸二酯键，断裂后形成的3-10个核苷酸的短链DNA从互补链上脱离，从而在DNA片段的两端产生长度为10-25个核苷酸的3’突出端，单链的长度取决于距离5’端最远的一个硫代修饰距离5’端的距离；

(3)将热处理后的目标基因DNA片段与质粒载体DNA片段杂交配对，形成含目标基因的带缺口重组质粒；

(4)所述含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌，修复重组质粒中的缺口，形成含目标基因的完整重组质粒。

2.根据权利要求1所述的仅基于化学试剂的新型基因克隆方法，其特征在于，步骤(1)中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因和质粒载体的正向引物、用于扩增目标基因和质粒载体段的反向引物、目标基因与质粒载体的DNA模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。

3.根据权利要求1所述的仅基于化学试剂的新型基因克隆方法，其特征在于，所述仅基于化学试剂的新型基因克隆方法在步骤(1)和步骤(2)之间还包括对质粒载体PCR产物用限制性核酸内切酶DpnI消化去除质粒模板。

4.根据权利要求1所述的仅基于化学试剂的新型基因克隆方法，其特征在于，步骤(2)中所述热处理时的温度为65-85℃，时间为1-15分钟。

5.根据权利要求1所述的仅基于化学试剂的新型基因克隆方法，其特征在于，步骤(3)中所述杂交配对是在室温下放置1～15分钟。

6.根据权利要求1所述的仅基于化学试剂的新型基因克隆方法，其特征在于，所述仅基于化学试剂的新型基因克隆方法还包括对含目标基因的完整重组质粒的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组质粒的阳性克隆，培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组质粒。