[发明专利]一种仿生辅酶偏好性的葡萄糖6-磷酸脱氢酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种仿生辅酶偏好性的葡萄糖6‑磷酸脱氢酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明采用半理性设计的方法，经过多轮定点饱和突变，提供了一系列来源于运动发酵单胞菌的葡萄糖6‑磷酸脱氢酶突变体。与野生型葡萄糖6‑磷酸脱氢酶相比，突变体利用仿生辅酶NMN⁺进行氧化还原反应的比酶活明显提高。本发明所示葡萄糖6‑磷酸脱氢酶将在糖产氢、糖产电等的工业生产中显示出巨大的潜在价值。

技术领域

本发明涉及一种仿生辅酶偏好性的葡萄糖6-磷酸脱氢酶突变体，具体的说是一种能够以仿生辅酶作为辅因子进行氧化还原反应的葡萄糖6-磷酸脱氢酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

天然辅酶（NAD(P)⁺）依赖型氧化还原酶被广泛的用于可替代传统有机合成的生物催化反应中。然而，天然辅酶昂贵的价格和不稳定性，限制了类似生物催化反应的规模化应用。

天然辅酶NAD(P)⁺是由负责电子传递的烟酰胺区域和负责在酶活性中心进行识别和定位的磷酸化或非磷酸化的腺苷二核苷酸组成。仿生辅酶（biomimetic cofactor）主要是以烟酰胺为母核，利用一些较稳定结构如糖、苯基、苯甲基等替换天然辅酶中腺苷二核苷酸而形成的。目前，报道过的仿生辅酶包括NFCD⁺（nicotinamide flucytosinedinucleotide）、NR⁺（nicotinamide mononucleoside）、NMN⁺（nicotinamidemononucleotide）和BNA⁺（1-benzyl nicotinamide）等。使用高稳定、低成本的仿生辅酶替代不稳定、昂贵的天然辅酶是降低辅酶使用成本的有效方法。然而，氧化还原酶利用仿生辅酶的催化能力及还原态仿生辅酶的再生，是目前亟待解决的问题。

体外多酶分子机器催化单糖、多糖等生产氢气、生物电的反应体系中，辅酶是介导电子和质子传递进而生成产物的关键（Zhu, Z., et al. (2014). A high-energy-density sugar biobattery based on a synthetic enzymatic pathway. Nat Commun.5: 3026; Kim, E.J., et al. (2018). Ultra-rapid rates of water splitting forbiohydrogen gas production through in vitro artificial enzymatic pathways.Energ Environ Sci. 11(8): 2064-2072）。对产氢和产电体外多酶体系中的葡萄糖6-磷酸脱氢酶（glucose 6-phosphate dehydrogenase, G6PDH, EC 1.1.1.49）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGDH，EC 1.1.1.44）进行仿生辅酶偏好性改造，具有重要的应用价值。

近期，有研究报道通过对6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶进行多轮定向进化，极大提高了该酶利用仿生辅酶NMN⁺进行氧化还原反应的能力（Huang, R., et al. (2019). A high-throughput method for directed evolution of NAD(P)⁺-dependent dehydrogenasesfor the reduction of biomimetic nicotinamide analogues. ACS catalysis. 11(18): 3120-3130）。因此，在基于NMN⁺的体外多酶体系生产氢气和生物电的工业生产中，亟需对葡萄糖6-磷酸脱氢酶进行NMN⁺偏好性改造。

发明内容

本发明的目的在于提供一种仿生辅酶偏好性的葡萄糖6-磷酸脱氢酶突变体及其应用。