[发明专利]里氏木霉来源的高选择性脂肪酶及其应用

说明书

本发明提供了一种里氏木霉来源的高选择性脂肪酶，所述脂肪酶可以对底物式5进行催化反应获得式6的化合物：其中，R为C1‑C6的烷基，所述式6的化合物为合成依米他韦的关键中间体。

技术领域

本发明属于药物领域，具体地涉及酶在化合物合成中的应用。

背景技术

丙型病毒性肝炎，简称丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％，估计约1.8亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)。

DAA(direct-acting antiviral agents)小分子丙肝药物是指直接抗丙型肝炎病毒的小分子药物。丙型肝炎病毒的非结构蛋白NS3/4A、NS5B和NS5A是目前DAA的主要作用靶位。NS3/4A丝氨酸蛋白酶参与对HCV病毒多肽链的多位点裂解和剪切，NS5B在HCV复制过程中编码RNA聚合酶，NS5A复制复合体蛋白在病毒复制和装配过程中起重要作用。DAA通过抑制HCV生命周期中的这些重要病毒蛋白，从不同阶段阻断HCV肝内复制进而发挥抗病毒疗效。

目前已经开发了一系列分别针对NS3/4A、NS5B和NS5A的DAA小分子丙肝药物，比如特拉匹韦(Telaprevir)、波普瑞韦(Boceprevir)、西咪匹韦(Simeprevir)、阿那匹韦(Asunaprevir)、索非布韦(Sofosbuvir)等。虽然这些DAA小分子丙肝药物给难治性丙肝患者带来了希望，但仍然面临着诸多挑战，比如生产成本高，耐药性增加，耐受性降低，副反应增加等。

依米他韦(式1)是一种新型HCV NS5A蛋白酶抑制剂：

现有技术中WO2014019344公开了依米他韦(式1)的化学合成途径，化学合成具有一定的局限性，其选择性也较低。采用具有更高选择性的脂肪酶进行依米他韦的合成，成本较低，更绿色环保。

发明内容

本发明提供了一种高选择性的脂肪酶，所述高选择性的脂肪酶可以用于依米他韦合成中的重要中间体(下式6)的合成：

(其中R为C1-C6的烷基)。利用高选择性的脂肪酶的合成方法具有选择性好，反应条件温和等优点，可以提高依米他韦合成过程中目标中间产物式6的收率，极大降低依米他韦类化合物的生产成本。

第一方面，本发明提供了一种高选择性脂肪酶或其活性片段，所述高选择性脂肪酶具有选自如下的氨基酸序列：

(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或

(2)在(1)中的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或者几个氨基酸的衍生的氨基酸序列，衍生的氨基酸序列具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的酶活性。

优选地，所述高选择性脂肪酶为来源于里氏木霉的L4脂肪酶。

第二方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码第一方面的高选择性脂肪酶或其活性片段。

优选地，所述分离的多核苷酸具有选自如下的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或

(2)在严格条件下与(1)限定的核苷酸序列杂交且编码具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的酶活性的氨基酸序列的多核苷酸序列。

第三方面，本发明提供了含有第二方面的多核苷酸序列的多核苷酸构建体。