[发明专利]用于检测HLA-B*58:01等位基因的引物组、探针、微流控芯片、检测方法及系统

说明书

本发明公开了一种用于检测HLA‑B*58:01等位基因的引物组、探针、微流控芯片、检测方法及系统。所述引物组包括三对特异性引物，其中第一正向引物、第二正向引物、第三正向引物的序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示。所述探针的序列如SEQ ID NO.5所示。本发明的微流控芯片可在外围小型化便携式系统的控制下全自动的完成从待检测样品进行基因组DNA提取纯化和等温核酸扩增检测，不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，具有灵敏度高、特异性强、反应程序简单、检测时间短等优点，本方法针对临床检测要求，引入RPA反应内控，保证检测反应的真实性和准确性。

技术领域

本发明涉及一种HLA-B*58:01等位基因的检测方法，尤其涉及一种用于检测HLA-B*58:01等位基因的引物组、探针、试剂盒及检测方法，以及一种微流控芯片、便携式控制装置及HLA-B*58:01等位基因检测系统，属于基因检测技术领域。

背景技术

别嘌醇是有效治疗高尿酸血症和痛风的一线药物，其价格低廉，降尿酸效果好，而且多项研究表明别嘌醇还具有抗氧化应激及改善内皮细胞功能，对全身多系统器官具有保护作用，是肾功能不全或排尿酸治疗无效患者的最佳选择，具有不可替代性。别嘌呤醇有引发超敏反应的风险，研究证实别嘌呤醇相关的严重超敏反应与HLA-B*58:01密切相关，亚裔人群的阳性率明显高于白人，故而发生超敏反应的险更大。Hung等人(PNAS,102(11)4134-4139(2015))对台湾地区发生的51例别嘌呤醇所致严重皮肤不良反应的患者和228例别嘌呤醇耐受者的研究中，发现与重症药疹呈强相关的SNP位点都位于MHC基因上，集中在HLA-A,B,C和DRB1基因座，尤其是HLA-B*58:01等位基因。HLA-B*58:01在服用别嘌呤醇后出现严重皮肤不良反应的患者中100％存在，而在未出现皮肤不良反应的患者(耐受人群)和正常对照组中，其携带率仅为15％和20％。在服用别嘌呤醇之前进行HLA-B*58:01等位基因检测，以判断是否属有关高危人群，对指导临床安全用药具有重要意义。因此，2008年我国台湾地区已经对于准备使用别嘌呤醇的患者实施该基因的检测，对于结果阳性的患者禁止使用，2012年美国风湿病学会(ACR)建议：亚裔人群在使用别嘌呤醇前，应该进行HLA-B*58:01检测，2013年中华医学会内分泌学会《高尿酸血症和痛风治疗中国专家共识》也推荐进行HLA-B*58:01检测。

HLA-B*58:01鉴定的“金标准”是国际组织相容性工作组(InternationalHistocompatibility Working Group,IHWG)所公布的碱基序列测序分析方法HLA-SBT，通过测序直接获得的核酸序列以鉴定多态性。但由于HLA系统的高度多态性和复杂性，以及引物设计等因素，测序结果会出现套峰，判读较为复杂。而且，HLA-SBT需要用到造价昂贵的测序仪，且测序样品制备对操作人员的要求较高，使得这一方法在医院常规展开比较困难。另一类方法是采用序列特异性引物PCR(PCR-SSP)进行HLA等位基因型筛查，如瑞士Olerup公司的SSP HLA试剂盒用二十多对引物分别扩增后用琼脂糖凝胶电泳分离进行基因型鉴定，耗时长，易污染，且操作极其繁琐。而且试剂盒针对欧美人群设计，一些欧美人群中常见的HLA等位基因在中国人群中并未出现。因此这类试剂盒不适合在国内医院临床应用。为解决在中国人群中对HLA-B*58:01快速检测的临床需求，台湾世基和苏州旷远分别开发了基于荧光定量PCR的试剂盒并已经CFDA认证。

但总体而言，现有技术检测HLA-B*58:01等位基因，依然存在仪器设备价格昂贵、对实验室环境要求严苛以及对操作人员技能的要求高，周期长、低效率等不足。