[发明专利]心肌细胞分离培养方法

说明书

本发明提供一种心肌细胞分离培养方法，包含以下步骤：1）取心脏组织，使用PBS液体清洗掉残留的血液；用眼科剪将心脏组织剪成0.1‑1mm³的组织块，加入0.5‑5mL的Ⅰ型胶原酶，36‑37.5℃条件下震荡消化0.5‑3小时；消化结束后加入2.5‑50mL PBS进行稀释中止，1200rpm/min离心5min，弃上清，获得细胞沉淀；2）将所述细胞沉淀用0.5‑5mL胰酶进行重悬，弯头吸管吹打10‑300次，消化液变浑浊后加入培养液终止胰酶消化，1200rpm/min离心5min，弃上清，获得原代心肌细胞。3）将所述原代心肌细胞用培养液进行重悬后，按照0.1‑10×10⁵个细胞/ cm²接种于培养液中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中进行培养，获得所述心肌细胞。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种体外心肌细胞的分离培养方法。

背景技术

心肌细胞是一种终末分化的成熟细胞，在维持心脏正常形态、结构方面具有重要意义。近年来，心脏的生理、病理发展研究和心血管相关药物开发及药理探究多采用体外培养的心肌细胞作为研究对象。

现有方法主要针对大鼠胎鼠或出生3天以内乳鼠的心肌细胞的分离，对成年大鼠和小鼠以及更多动物来源的心肌细胞的分离并不适用。然而在心肌细胞的细胞及分子学研究层面，往往需要获取成年动物或老龄化动物模型的心肌细胞或更多不同种属的心肌细胞，现行方法并不能满足研究需要。

专利CN201611017279.X公开了一种心肌细胞分离方法，该方法采用单纯胰酶消化分离心肌细胞的方法。胰酶消化的原理是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。但是不同种属，甚至同一种属来源的不同组织对相同浓度胰酶的作用反应不一样。同时胰酶消化活力与其浓度、温度和时间均有关。采用单纯胰酶消化分离心肌细胞过程中，若对其中任一细节不能精准控制，会造成消化过度或消化不到位。消化过度即胰酶对细胞膜蛋白进行水解，对细胞造成不可逆损伤，最终影响分离后心肌细胞的活性；消化不到位则无法顺利将心肌细胞从组织中分离出来。

专利CN201810915252.5公开了一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法,该方法采用胰酶和Ⅱ型胶原酶联合消化的方法进行分离。正常情况下，心肌组织间质中主要胶原类别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五种，其中Ⅰ型（占心肌胶原总量的80%）、Ⅲ型（占心肌胶原总量的11%）为主。采用Ⅱ型胶原酶进行分离，对Ⅰ、Ⅲ型胶原无法进行针对性水解消化。

专利CN201610218220.0公开了一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，该方法采用质量比为1:1:1:1的Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶和Dispase酶（一种非特异性的金属蛋白酶）的复合酶进行4℃消化过夜的方式进行分离。此法可以对心肌组织中胶原成分进行针对性消化，有效减少胰酶对细胞的损伤风险。但是心肌细胞会随着离体时间的延长活性逐渐降低。复合酶中并无心肌细胞存活所必须的各种培养液组分，采用4℃低温消化时间过长，不利于心肌细胞分离后的活性维持。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种心肌细胞分离和培养方法。

为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种心肌细胞分离培养方法，包含以下步骤：

1）取心脏组织，使用PBS液体清洗掉残留的血液；用眼科剪将心脏组织剪成0.1-1mm³的组织块，加入0.5-5mL的Ⅰ型胶原酶，36-37.5℃条件下震荡消化0.5-3小时；消化结束后加入2.5-50mL PBS进行稀释中止，1200rpm/min离心5min，弃上清，获得细胞沉淀；

2）将所述细胞沉淀用0.5-5mL胰酶进行重悬，弯头吸管吹打10-300次，消化液变浑浊后加入培养液终止胰酶消化，1200rpm/min离心5min，弃上清，获得原代心肌细胞。