[发明专利]一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12

说明书

本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B₁₂高产菌株的筛选方法和筛选培养基。本发明所提供的脱氮假单胞菌发酵生产维生素B₁₂高产菌株筛选培养基逐渐变化配方成分，使用该培养基可以使菌株的生命活性逐渐恢复，回复菌株生产活性，使菌株更能适应于发酵生产，避免了菌株活化不足，生产能力降低的问题，而且该筛选培养基中不含抗生素。避免造成抗生素污染的同时，又可以很好的筛选出高产维生素B₁₂菌株，保证用于发酵生产的菌株能力不断趋于最高最强，提高了发酵生产水平，还避免了菌株突变，导致发酵生产单位突然降低，生产成本上升的问题。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B₁₂高产菌株的筛选方法和筛选培养基。

背景技术

维生素B₁₂又称钴胺素，它是一系列含有以钴原子为中心的咕啉核和以5，6～二甲苯并咪唑为碱基的核苷酸，并对人和动物具有生物活性的类咕啉同功维生素总称，主要活性品种有氰钴铵、羟钻铵、腺苷钴铵和甲钴铵。

人类和动植物都不能合成维生素B₁₂，而维生素B₁₂又是人体组织代谢过程中必需的维生素，是人和其它哺乳动物维持生长和促进红细胞生长的重要因子，具有广泛的生理作用，参与体内甲基转换及叶酸代谢，促进神经髓鞘中脂蛋白的形成，保持中枢神经和外围髓鞘神经纤维的功能完整。因此，维生素B₁₂主要用于治疗恶性贫血,亦与叶酸合用用于治疗各种巨幼红细胞性贫血、抗叶酸药引起的贫血及脂肪泻。还用于神经系统疾病(如神经炎、神经萎缩)的治疗等。

目前国内外商品化的维生素B₁₂生产，几乎都是通过微生物发酵法进行的。其中，因脱氮假单胞杆菌好氧合成维生素B₁₂的途径清晰明了且维生素B₁₂产率高，因此几乎都是使用脱氮假单胞杆菌来作为生产维生素B₁₂的工业菌株。脱氮假单胞杆菌好氧发酵生产维生素B₁₂的过程控制条件比较严格，一旦控制不好就会导致菌体发虚早衰进而影响维生素B₁₂的产量。因此，发酵过程中选择高产的菌株并维持脱氮假单胞杆菌的形态及活力至关重要。此外，在生产实践中，选育出产物产量高,遗传性状稳定和发酵条件优良的菌株对于维生素B₁₂的微生物发酵生产具有非常现实的意义。

现有工艺一般将冷冻保藏的菌株活化后即用于发酵生产，由于脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12菌株突变率较高，多次传代后，发酵单位忽高忽低，不利于工业生产。

发明内容

为了解决上述问题，本发明根据脱氮假单胞菌的生长特性，提供了一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B₁₂高产菌株的筛选方法以及筛选培养基，采用温和的菌株逐级活化的方法对生产菌株进行复筛，筛选出高产菌株，可有效避免菌株活化不足，生产能力降低导致生产成本偏高。

本发明提供的技术方案为一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B₁₂高产菌株的筛选方法，包括下述步骤：

步骤一：将一级固体种子培养基消毒灭菌，分装到无菌平皿中；平皿中培养基冷却凝固后，在无菌室使用产维生素B₁₂脱氮假单胞菌菌株进行平板稀释涂布；平板稀释涂布完成，将平皿置入恒温培养箱中进行培养；

步骤二：将二级固体种子培养基消毒灭菌，分装到无菌试管中，制成二级固体种子培养基试管斜面；二级固体种子培养基试管中培养基冷却凝固后，挑选步骤一中培养完成的脱氮假单胞菌单菌落，在无菌室中分别划线接种到二级固体种子培养基试管斜面中；二级固体种子培养基试管斜面分别接种单菌落完成后，将其置入恒温培养箱中进行培养；