[发明专利]一种通过yoaD和yoaE基因共缺失提高大肠杆菌GlmS酶活力的方法

说明书

本发明涉及一种通过yoaD和yoaE基因共缺失提高大肠杆菌GlmS酶活力的方法，属于基因工程技术领域。一种yoaD、yoaE表达基因通过负向调控提高重组菌的GlmS酶活力的应用，所述yoaD表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述yoaE表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次发现了大肠杆菌染色体上的yoaD与yoaE基因敲除后可以提高菌株表达外源GlmS酶的能力，且它们之间具有叠加增效的技术效果，这对于整个氨糖的合成途径有着重要的意义，并且敲除成功后不会留下任何抗性基因残留；两个基因的共缺失后，使得工程菌株表达外源GlmS的能力较原始菌株提高3倍左右。

技术领域

本发明涉及一种通过yoaD和yoaE基因共缺失提高大肠杆菌GlmS酶活力的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)，俗称氨基糖，简称氨糖，是葡萄糖的一个羟基被一个氨基取代的化合物，是形成软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成分，还是糖蛋白的主要组成部分。GlmS是氨糖生产的关键酶蛋白，因此其酶活的提高将对GlcN的生产有至关重要的作用。

中国专利文献CN109929791A(申请号201910301799.0)公开了一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用，属于遗传工程技术领域。以大肠杆菌作为宿主表达，通过敲除大肠杆菌中氨基葡萄糖合成途径中的4个基因：乙酰氨基葡萄糖转运子编码基因nagE、甘露糖磷酸转运子编码基因manXYZ、脱乙酰基酶基因nagA和脱氨基酶基因nagB基因，获得重组大肠杆菌，并将重组大肠杆菌应用于氨基葡萄糖的生产中，实现了阻断产物氨基葡萄糖由胞外到胞内的运输途径；并通过过量表达氨基葡萄糖合成酶编码基因、氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因，加强了氨基葡萄糖的合成途径，从而提高氨基葡萄糖的产量。

yoaD与yoaE是大肠杆菌染色体上的组成性基因，其中，yoaD的基因大小为1599bp，它的作用是能刺激第二信使循环di-gmp的降解,与GGDEF结构域一起，EAL可能参与调节细菌的细胞表面粘附性；yoaE的基因大小为1557bp，它的作用是构成内膜蛋白，调控某些离子的转移，构成内膜蛋白。

由于菌种中调控表达外源GlmS的信号途径十分复杂，因此，寻找影响外源GlmS表达调控的基因，对于提高GlmS表达量，进而提高氨糖的产量具有重要的作用。

发明内容

本发明针对GlmS自然条件下表达量相对较低的现状，提出一种通过yoaD和yoaE基因共缺失的方法，提高大肠杆菌GlmS酶活力的方法。

本发明技术方案如下：

一种yoaD表达基因通过负向调控提高重组菌的GlmS酶活力的应用，所述yoaD表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种yoaE表达基因通过负向调控提高重组菌的GlmS酶活力的应用，所述yoaE表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明优选的，所述重组菌为重组大肠杆菌。

一种提高重组菌的GlmS酶活力的方法，通过敲除GlmS酶表达菌中的yoaD表达基因和yoaE表达基因制备重组菌实现；所述yoaD表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述yoaE表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明优选的，所述方法，步骤如下：

(1)将pKD46质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，构建BL21-pKD46工程菌株；

(2)将yoaD基因上游区的500bp碱基，pKD13质粒中的FRT-kan-FRT结构框和yoaE基因的下游区500bp碱基利用重叠PCR构建成整合片段-1；

(3)将步骤(2)中的整合片段-1转化进入经过诱导的BL21-pKD46感受态细胞；