[发明专利]表达Caspase-3重组scFv78的重组大肠杆菌及其功能验证方法

说明书

本发明提供了一种表达Caspase‑3重组scFv78的重组大肠杆菌及其功能验证方法。该技术方案首先将整合有Caspase‑3编码基因的重组单链抗体scFv78编码基因通过酶切酶连的方法与pET302载体连接，再利用所得的重组质粒转化至大肠杆菌Nissle1917中，从而得到能够表达Caspase‑3重组scFv78的菌株。本发明中采用大肠杆菌Nissle1917的胞内侵袭、聚集的特性和scFv78对TEM1阳性细胞的定点靶向特性，实现人源毒素Caspase‑3蛋白位点特异性地发挥作用，从而更准确地杀伤TEM1阳性肿瘤细胞，降低对机体正常细胞的损伤。在此基础上，本发明利用重组菌表达人源毒素Caspase‑3重组单链抗体scFv78蛋白，再在体外环境下将蛋白与MS1‑TEM1细胞共孵育，从而验证其对肿瘤细胞的亲和力及杀伤力。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，进一步涉及生物制药及肿瘤医学技术，具体涉及一种表达Caspase-3重组scFv78的重组大肠杆菌及其功能验证方法。

背景技术

目前针对肿瘤的治疗有化学、物理和生物方法等，但上述疗法始终未能达到治疗肿瘤的理想效果，因此探索更安全、更有效地新型肿瘤治疗方法迫在眉睫。自WilliamColey首次利用细菌治疗肿瘤以来，细菌靶向治疗肿瘤己成为近年国际研究的热点，多种细菌被发现可特异性的侵入机体肿瘤组织并大量繁殖，利用活菌治疗肿瘤的设想就随之产生。

靶向治疗是指抗肿瘤药物能针对性地与肿瘤的特异性位点结合，从而对肿瘤细胞起到杀伤效果，而对健康组织基本无影响，是目前较为理想的治疗模式，也代表着肿瘤治疗的未来趋势。其主要分为单克隆抗体药和抗体药物偶联物 (Antibody Drug Conjugates，ADC)。ADC药物是一类新颖的治疗药物，正日益受到全球制药公司的关注。ADC药物由单克隆抗体和强效毒性药物(toxic drug) 通过生物活性连接器(linker)偶联而成，是一种定点靶向癌细胞的强效抗癌药物。由于其对靶点的准确识别性及非癌细胞不受影响性，极大地提高了药效并减少了毒副作用。

内皮唾液酸蛋白(又称肿瘤内皮细胞标志分子1，TEM1/CD248)是一种Ⅰ型跨膜蛋白，由一个被糖基化修饰的80.9KDa的蛋白核心区组成，修饰后成熟的糖蛋白大约为175KDa。TEM1是近期发现的人类肿瘤标记物之一，其对肿瘤的细胞生长、血管生成浸润及转移有重要作用。肿瘤内皮细胞标志分子1 (TEM1/CD248)在多种实体瘤上(内皮细胞和基质细胞)高表达，如肉瘤，脑肿瘤，乳腺癌，皮肤癌、结肠癌，且实验表明在卵巢癌中，TEM1的表达与肿瘤的浸润、预后密切相关。因此，TEM1在正常组织不表达或者低表达，而在肿瘤血管组织高表达的特点，所以TEM1可作为癌症治疗的针对肿瘤血管的生物标物。既往研究获得了TEM1特异性的单链抗体单链可变区片段(Single-Chain Variable Fragment，scFv78)。scFv78是与具有高亲和力的单链抗体，并对人和鼠的均存较高的亲和力，因此可以考虑将TEM1作为临床前模型中的一个靶分子。