[发明专利]表达HER2单链抗体的重组大肠杆菌Nissle 1917及其功能验证方法

说明书

本发明提供了一种表达HER2单链抗体的重组大肠杆菌Nissle 1917及其功能验证方法。该技术方案首先将HER2单链抗体的编码基因通过酶切酶连的方法与pet28c载体连接，再利用所得的重组质粒转化至大肠杆菌Nissle 1917中，从而得到重组大肠杆菌Nissle 1917。本发明中采用对HER2阳性细胞的定点靶向特性和大肠杆菌Nissle 1917在肿瘤内聚集的特性，位点特异性地实现HER2抗体蛋白的表达，从而更准确地杀伤HER2阳性肿瘤细胞，降低对机体正常细胞的损伤。在此基础上，本发明提供了考察该重组菌抗肿瘤功效的一种实验方法，将活化后的菌株采用灌胃或尾静脉注射的方式处理乳腺癌动物模型，再考察其肿瘤体积的变化。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，进一步涉及生物制药及肿瘤医学技术，具体涉及一种表达HER2单链抗体的重组大肠杆菌Nissle 1917及其功能验证方法。

背景技术

目前针对肿瘤的治疗有化学、物理和生物方法等，但上述疗法始终未能达到治疗肿瘤的理想效果，因此探索更安全、更有效地新型肿瘤治疗方法迫在眉睫。自WilliamColey首次利用细菌治疗肿瘤以来，细菌靶向治疗肿瘤己成为近年国际研究的热点，多种细菌被发现可特异性的侵入机体肿瘤组织并大量繁殖，利用活菌治疗肿瘤的设想就随之产生。

靶向治疗是指抗肿瘤药物能针对性地与肿瘤的特异性位点结合，从而对肿瘤细胞起到杀伤效果，而对健康组织基本无影响，是目前较为理想的治疗模式，也代表着肿瘤治疗的未来趋势。其主要分为单克隆抗体药和抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates，ADC)。ADC药物是一类新颖的治疗药物，正日益受到全球制药公司的关注。ADC药物由单克隆抗体和强效毒性药物(toxic drug)通过生物活性连接器(linker)偶联而成，是一种定点靶向癌细胞的强效抗癌药物。由于其对靶点的准确识别性及非癌细胞不受影响性，极大地提高了药效并减少了毒副作用。

在乳腺癌患者中约25％～30％呈现出人表皮生长因子受体-2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2)的过表达，这种类型的乳腺癌通常具有较高的临床及病理分期和较差的预后。HER2也称为受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)erbB-2，为HER家族成员之一，主要由胞外域配体结合区、单链跨膜区及胞内域蛋白酪氨酸激酶区这3部分组成。因为无相应配体，通常与HER家族其他成员如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR/HER1)和HER3等形成二聚体，引起胞内域酪氨酸激酶区的自身磷酸化，启动细胞内信号级联反应，维持细胞的生存与发育，促进细胞增殖和迁移等。HER2的过表达通过启动多种转移相关机制而增加转移能力，HER2过表达的乳腺癌恶性程度相对较高，容易出现淋巴结、骨、肺等处转移，HER2过表达也影响某些黏附分子如上皮细胞钙黏蛋白(E-cadher-in)等合成，从而促进肿瘤细胞的转移。HER2单链抗体能与乳腺癌细胞过表达的HER2进行强有力的结合，从而抑制HER2过表达引起的一系列癌细胞增殖和转移的过程。

尽管对乳腺癌具有确切的治疗作用，但常规给药方式下HER2单链抗体在患者体内均匀分布，无法在肿瘤内特异性聚集，使其靶向性有待提升。在这种情况下，如果能对HER2单链抗体进行结构改进，以实现其对实体肿瘤或肿瘤细胞的专一性，那么则有望进一步提升HER2单链抗体的抗肿瘤效果。然而，要实现这一目的，采用化学偶联方法还是微生物重组方法、选择怎样的载体、二者如何实现分子水平的连接，诸多问题尚有待解决。

非致病性大肠杆菌Nissle 1917作为一种益生元在欧洲己经获得治疗肠病的认证长达九十余年，大量的试验、临床依据表明，这种细菌药物是有效和安全的。有研究表明大肠杆菌对血清敏感，对实体瘤具有偏好性且可在实体瘤内大量增殖，鉴于这一特性，人们尝试以其为宿主菌构建可表达外源基因药物的工程菌来特异性的治疗癌症。

发明内容