[发明专利]一种通过过表达PSMB5促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法

说明书

本发明涉及一种通过过表达PSMB5促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，步骤如下：⑴包含牛PSMB5基因序列的目的序列的获取；⑵表达载体pcDNA3.1‑PSMB5的构建；⑶pcDNA3.1‑PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞：用得到的表达载体pcDNA3.1‑PSMB5，采用脂质体转染试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，使牛骨骼肌卫星细胞过表达PSMB5，利用PSMB5的作用，提高牛骨骼肌卫星细胞的体外分化能力。本发明方法利用PSMB5对牛肌卫星细胞的增殖和成肌分化进行调控，可以为肌肉发育分化的泛素化过程的研究提供启示，并为肌肉发育分化及损伤修复的临床研究及诊治提供新的思路和参考。

技术领域

本发明属于生物、细胞技术领域，尤其是一种通过过表达PSMB5促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法。

背景技术

骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cell)是骨骼肌中具有增殖分化潜能的肌源性干细胞，通常以静息状态存在于肌纤维肌膜与基底膜之间，在一定的条件下可以被激活，发生增殖和分化，形成骨骼肌细胞，肌卫星细胞在动物出生后肌肉的生长发育和再生过程中发挥着十分重要的作用。肌卫星细胞的激活、增殖与分化过程受多种因素的调控，了解骨骼肌卫星细胞的发生调控模式，可以增加人为控制肌细胞形成的可能性。

骨骼肌增殖和分化过程涉及多基因的表达、信号途径及网络式调控，过程极其复杂。已有研究表明泛素-蛋白酶体系统参与调节细胞周期进程、细胞增殖与分化、以及信号传导等多种生物学过程。26S蛋白酶体是降解泛素化底物的一个ATP依赖型蛋白水解复合体，由20S核心蛋白酶体和19S调节颗粒构成。20S是一个圆筒形结构，由α亚基和β亚基构成的4个环层叠组成，内侧的2个β环具有蛋白酶催化水解活性，β1、β2和β5为活性亚基，具有特异性肽切割位点，是整个泛素-蛋白酶体通路降解蛋白的关键位点。其中，蛋白酶体β5亚基(PSMB5)具有糜蛋白酶样活性。可以利用表达载体将PSMB5转染导入细胞或动物体内，用于研究蛋白酶体的功能，一般导入细胞或动物体内的PSMB5基因，使用包含PSMB5基因CDS区的序列。利用PSMB5来促进牛肌卫星细胞成肌分化，借助此方法可以为肌肉发育分化及损伤修复中泛素-蛋白酶体系统的利用提供借鉴，并为肌肉发育分化及损伤修复的临床研究及诊治提供新的思路和方法。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术环境胁迫问题的不足之处，提供一种通过过表达PSMB5促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，该方法利用PSMB5对牛肌卫星细胞的增殖和成肌分化进行调控，可以为肌肉发育分化的泛素化过程的研究提供启示，并为肌肉发育分化及损伤修复的临床研究及诊治提供新的思路和参考。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种通过过表达PSMB5促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，步骤如下：

⑴包含牛PSMB5基因序列的目的序列的获取：

根据牛PSMB5基因序列设计一对PCR引物，在两个引物的5’端分别引入XhoI酶切位点和XbaI酶切位点，利用该对引物从牛基因组中扩增出包含PSMB5基因的CDS区序列，长度为792bp；

⑵表达载体pcDNA3.1-PSMB5的构建：

用XhoI和XbaI双酶切步骤⑴中所得序列及pcDNA3.1载体，通过连接酶连接，使所述序列插入质粒载体pcDNA3.1的XhoI和XbaI酶切位点，构建出牛PSMB5基因的表达载体pcDNA3.1-PSMB5；

⑶pcDNA3.1-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞：

用得到的表达载体pcDNA3.1-PSMB5，采用脂质体转染试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，使牛骨骼肌卫星细胞过表达PSMB5，利用PSMB5的作用，提高牛骨骼肌卫星细胞的体外分化能力。