[发明专利]毕赤酵母转录因子HAC1、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用

权利要求书

1.毕赤酵母转录因子HAC1，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID No.1。

2.毕赤酵母转录因子HAC1的制备方法，其特征在于是以毕赤酵母Pichia pastorisGS115的基因组DNA为模板，以HAC1-F：GgaattcACGATGCCCGTAGATTCTTCTC及HAC1-R：ATAAGAATgcggccgcTCACCTGATCGCTATGC为引物进行PCR扩增获得。

3.利用毕赤酵母转录因子HAC1编码的蛋白，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID No.2。

4.利用毕赤酵母转录因子HAC1转化的巴斯德毕赤酵母，其特征在于其拉丁文名称为Pichia pastoris，保藏编号为CGMCC No.18909。

5.根据权利要求4所述的巴斯德毕赤酵母的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

a、毕赤酵母转录因子HAC1以GeneBank公布的Gene ID8196642设计引物，以毕赤酵母Pichia pastoris GS115的基因组DNA为模板，以HAC1-F：GgaattcACGATGCCCGTAGATTCTTCTC及HAC1-R：ATAAGAATgcggccgcTCACCTGATCGCTATGC为引物进行PCR扩增，下划线字母代表设计加入的酶切位点；

b、PCR产物经纯化回收后由于在目的基因片段两端分别引入了EcoRI、NotI限制性酶切位点，将毕赤酵母转录因子HAC1与pPICZB载体分别使用限制性内切酶EcoR I、Not I双酶切，毕赤酵母转录因子HAC1与pPICZB载体各自的双酶切回收产物经1％琼脂糖凝胶核酸电泳检验后，用T4 DNA连接酶连接，转化到E.coli DH5α，双酶切验证筛选阳性转化子，并送测序；

c、重组质粒HAC1/pPICZB采用限制性内切酶SacI线性化，取切好的质粒2微克，冰上放置20分钟后，电转毕赤酵母GS115/Pn-GOD感受态细胞构建重组菌，电转条件：1.5Kv、5ms，快速加入1毫升YPDS液体培养基，电转的感受态细胞置于30℃金属浴静置培养2-6小时，在5000转/分钟的转速下离心2分钟，弃上清，用1毫升灭菌的0.9％生理盐水洗3次，将重组质粒HAC1/pPICZB电转后的菌液涂布于含有200微克/毫升博来霉素和1000微克/毫升G418的YPD平板上，30℃恒温培养3天后获得阳性转化子，挑取单菌落接种于含1000μg/mLG418和200μg/mLZeocin的5mL液体YPCS试管培养基中，14-22小时后加1％(v/v)甲醇，之后24小时和48小时后均各加1％(v/v)甲醇诱导，96小时收菌，12000转/分钟离心1分钟收集上清，测定葡萄糖氧化酶活力，筛选高酶活重组菌株，获得巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCCNo.18909。

6.根据权利要求5所述的巴斯德毕赤酵母的制备方法，其特征在于其中：

YPD培养基由如下原料组成：1％Yeast extract；2％Peptone；2％Glucose；余量为水；

YPDS培养基由如下原料组成：1％Yeast extract；2％Peptone；2％Glucose；0.5％Sorbitol；余量为水。

7.根据权利要求4所述的巴斯德毕赤酵母在制备葡萄糖氧化酶中的应用。