[发明专利]一种促进N-乙酰氨基葡萄糖生产的RamA转录因子突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种促进N‑乙酰氨基葡萄糖生产的RamA转录因子突变体及其应用。本发明的突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亲本上，将90位的赖氨酸突变为天冬酰胺，以及将92位的丝氨酸突变为赖氨酸。本发明提供了一种促进N‑乙酰氨基葡萄糖生产的RamA转录因子突变体，并提供了过表达RamA转录因子突变体，能提高N‑乙酰氨基葡萄糖产量的基因工程菌株，通过过表达参与碳代谢调控的转录因子RamA，提高了N‑乙酰氨基葡萄糖在胞外的积累量，其浓度最高可达31.5g/L，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。

技术领域

本发明涉及一种促进N-乙酰氨基葡萄糖生产的RamA转录因子突变体及其应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是氨基葡萄糖的一种衍生物，具有还原性，也是合成双岐因子和透明质酸的重要前体物质，又称2-(乙酰氨基)-2-脱氧-葡萄糖及N-乙酰葡萄糖胺，是生物体内多种多糖的基本组成单位，在生物体内具有重要的生理功能。谷氨酸棒杆菌是放线菌门中高GC含量的革兰氏阳性土壤细菌，已被用于氨基酸的工业生产，并被设计用于生产各种化合物，包括聚合物结构单元和生物燃料。自其基因组序列首次发表以来，其多功能代谢途径及其遗传成分和调控机制已得到广泛研究。为了提高生物技术生产的效率，基于基因组序列信息开发了遗传工具和基于组学的分析方法，包括转录组学，蛋白质组学，代谢组学和流变学，并广泛用于了解代谢途径及其在转录后的调控。

在过去的研究中，为了提高谷氨酸棒杆菌中目标基因的表达量，学者们往往采用基因组改造、启动子以及RBS序列的优化、利用定点突变技术以及改造转运系统等方式。要想实现真正意义上的工程菌株的定性改造和细胞工程的理性设计，必须从细胞整体和系统全局出发，综合考虑基因表达、转录调控以及代谢反应之间的相互作用关系。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种促进N-乙酰氨基葡萄糖生产的RamA转录因子突变体，使得谷氨酸棒杆菌中的碳代谢流更多地流向N-乙酰氨基葡萄糖生产，从而提高了谷氨酸棒杆菌生产N-乙酰氨基葡萄糖的能力，具有重要的经济价值和社会意义。

本发明的第一个目的是提供一种促进N-乙酰氨基葡萄糖生产的RamA转录因子突变体，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亲本上，将90位的赖氨酸突变为天冬酰胺，以及将92位的丝氨酸突变为赖氨酸。

进一步地，所述的亲本的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的RamA转录因子突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述的RamA转录因子突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供一种提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的基因工程菌，所述基因工程菌是以谷氨酸棒杆菌为宿主菌，过表达RamA转录因子突变体。

进一步地，所述的宿主菌为谷氨酸棒杆菌S9114ΔnagA-ΔgamA-Δldh。

进一步地，所述的基因工程菌是以pTYW-4-ceN-C.glglmS为表达载体。表达载体pTYW-4-ceN-C.glglmS具体构建过程参见文献——Chen Deng,Xueqin Lv,Yanfeng Liu,Long Liu.Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum S9114 based onwhole-genome sequencing for efficient N-acetylglucosamine synthesis.Syntheticand Systems Biotechnology,2019.4:120-129。

本发明的第三个目的是提供所述的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：