[发明专利]一种由高温诱导表达的启动子及其应用

说明书

本发明公开了一种由高温诱导表达的启动子及其应用，属于基因工程技术领域。本发明利用一种启动子片段，该启动子来源于产甘油假丝酵母对温度敏感的一个基因，YWP1。本发明提供的启动子序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的启动子能够特异的驱动外源基因在高温诱导条件下在产甘油假丝酵母中高表达。应用该启动子诱导表达木糖还原酶基因，在42℃培养条件下可使木糖醇的产量达到15.45g/L，比30℃诱导的产量5.07提高了3倍以上，在实际应用中具有显著价值。

技术领域

本发明涉及一种由高温诱导表达的启动子及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

在外部环境发生变化的时候，维持功能内平衡的能力对所有微生物的生存至关重要。温度是影响微生物生长和生存的重要环境因素之一。大规模的工业发酵常常产生大量的热量，凝结水的消耗增加了发酵成本，发酵过程中的污染和温度波动引起的酵母细胞死亡必然导致巨大的产量损失。

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes,CCTCC：M93018)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，在中国专利CN1070235C中公开，公告日2001年8月29日，具有耐高温，高产量，高转化率，生产强度大等特点，居世界领先地位。它能在25％葡萄糖或5％NaCl的高渗透压培养基上正常生长，在实验室规模发酵中，甘油产量可达12％，即使在工业化规模中，甘油产量也达10％。同时，产甘油假丝酵母在发酵过程中温度会随着发酵时间的延长逐渐升高。甘油产量依然维持在较高水平。相对于模式菌株酿酒酵母而言，产甘油假丝酵母具有良好的在高温条件下生长的特性。

启动子是基因表达调控的顺式元件，也是基因工程表达载体的一个重要元件。启动子在转录水平上的重要作用，决定了基因的表达水平，可以说启动子活性的高低在很大程度上影响着基因表达最终产物的表达水平。木糖还原酶(XR)是木糖代谢的关键酶，催化木糖还原为木糖醇。来自Neurospora crassa的XR在高温下具有较高的Kcat和NADPH催化效率。本实验由来自Candida glycerinogenes的高温诱导启动子调控来自Neurosporacrassa的木糖还原酶基因的表达，在高温条件下发酵。

发明内容

本发明的目的在于应用适当的高温诱导控制外源基因的选择性表达，并由此提供一种受高温诱导的启动子及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种受高温诱导的启动子，其核苷酸序列为SEQ IDNO.1。

在一种实施方式中，所述高温诱导指在30～45℃诱导。

本发明的第二个目的是提供含有所述启动子的表达载体。

本发明的第三个目的是提供含有所述启动子的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞是产甘油假丝酵母细胞。

在一种实施方式中，所述产甘油假丝酵母以pUGA为载体，表达目的基因。

在一种实施方式中，所述目的基因为木糖还原酶基因。

一种高温诱导生产木糖醇的方法，包括如下步骤：

(1)将SEQ ID NO.1所示的启动子片段和木糖还原酶基因分别连接至载体上，获得重组质粒；

(2)在步骤(1)制备的重组质粒转化至宿主细胞中，获得重组菌；

(3)将重组菌在含甘油和木糖的培养基中培养，并控制培养温度为30～45℃。

在一种实施方式中，所述木糖还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述培养基含有30～50g/L木糖、10～30g/L甘油、10～30g/L蛋白胨、5～15g/L酵母粉。