[发明专利]一种蛋白质因子RRF编码基因及其在N-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用

说明书

本发明涉及一种生产N‑乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，属于代谢工程领域。该重组谷氨酸棒杆菌通过在谷氨酸棒杆菌中过表达自身来源的核糖体循环因子RRF得到。本发明的重组谷氨酸棒杆菌提高了乙酰氨基葡萄糖的产量，产量达到26.9g/L，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

技术领域

本发明涉及代谢工程领域，尤其涉及一种一种蛋白质因子RRF编码基因及其在N-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是氨基葡萄糖的一种衍生物，具有还原性，也是合成双岐因子和透明质酸的重要前体物质，又称2-(乙酰氨基)-2-脱氧-葡萄糖及N-乙酰葡萄糖胺，是生物体内多种多糖的基本组成单位，在生物体内具有重要的生理功能。谷氨酸棒杆菌是放线菌门中高GC含量的革兰氏阳性土壤细菌，已被用于氨基酸的工业生产，并被设计用于生产各种化合物，包括聚合物结构单元和生物燃料。自其基因组序列首次发表以来，其多功能代谢途径及其遗传成分和调控机制已得到广泛研究。为了提高生物技术生产的效率，基于基因组序列信息开发了遗传工具和基于组学的分析方法，包括转录组学，蛋白质组学，代谢组学和流变学，并广泛用于了解代谢途径及其在转录后的调控。

在以往的研究中，相对于基因调控的探索往往在转录水平，经过理论体系不断的优化、研究的深入，逐渐对翻译过程也重视起来。经过不断摸索研究，己经发现多种不同的蛋白因子参与了原核细胞翻译起始延长以及终止的进程。其中一个很重要的蛋白质是核糖体循环因子RRF(ribosome recycling factor)，它可以促进终止核糖体复合物拆开，从而使得翻译过程结束，RRF表达的增多会促进生长后期的蛋白合成以及部分代谢产物的增加。文献“代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸，2015年，赵建勋”公开了RRF促进谷氨酸棒状杆菌L-异亮氨酸合成，同时申请号为201410726700.9的中国专利公开了一株产L-异亮氨酸基因工程菌的构建方法及应用，其公开了扩增基因fusA，frr，ilvBN，ilvA，ppnk以提高谷氨酸棒状杆菌L-异亮氨酸产量。但上述文献均未公开过表达RRF可提高谷氨酸棒状杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖产量。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种一种蛋白质因子RRF编码基因及其在N-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用，本发明通过在谷氨酸棒杆菌中过表达frr基因，从而过表达核糖体循环因子RRF，而得到了N-乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组谷氨酸棒杆菌。

本发明的技术方案如下：

本发明的一种产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌，该重组谷氨酸棒杆菌通过在出发菌谷氨酸棒杆菌中过表达自身来源的核糖体循环因子RRF得到。

进一步地，出发菌谷氨酸棒杆菌敲除了乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA及L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh。

进一步地，出发菌谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA-Δldh。谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA-Δldh是以谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA为出发菌株，在其基础上敲除了L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh得到。其中，L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh如NCBI-Gene ID:1020853所示。谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA的构建方法参照CN 110195036A。通过敲除编码催化由丙酮酸形成乳酸的L-乳酸脱氢酶的ldh基因，来阻断宿主菌谷氨酸棒杆菌合成副产物乳酸的途径。

进一步地，核糖体循环因子RRF的编码基因为frr，frr的基因序列如NCBI-GeneID:1019979所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，frr基因所编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示。