[发明专利]人源化细胞因子IL15基因改造非人动物的构建方法及应用

说明书

本发明提供了一种人源化IL15基因改造非人动物的构建方法，利用同源重组的方式将编码人IL15蛋白的核苷酸序列导入动物基因组中，从而构建出基因修饰人源化动物，该动物体内能正常表达人或人源化IL15蛋白，促进人T细胞和NK细胞的发育，可以作为人IL15信号机理研究、肿瘤等疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于基因编辑的IL15基因修饰人源化动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

恶性肿瘤对人类的威胁日益增大。由于肿瘤的发生通常是潜伏的，诊断时，往往已经到了转移期或者晚期，因此该疾病的死亡率依然很高。目前对癌症的治疗主要是依靠手术、放疗和化疗，但是仍有70％的患者不仅没有达到预期的效果，反而饱受化疗副作用的折磨。随着生命科学的发展，恶性肿瘤细胞内的信号转导，细胞周期的控制，细胞凋亡的诱导，血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等基本过程正在被逐步阐明，特别是一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路，而肿瘤的细胞因子基因疗法也被广泛的应用在肿瘤的治疗中。

IL15(interleukin-15)是1994年由Grabstein在检测猴肾内皮细胞株CV-1/EBDN的培养上清中发现并命名的重要可溶性细胞因子。人IL15基因定位于人染色体4q31位点，长32kb，有8个外显子，其中1、2外显子不编码，编码162个氨基酸，前导肽48个氨基酸，成熟蛋白由114个氨基酸组成，含有2个潜在的N-糖基化位点(N79，N112)，其受体亚基包括IL15Rα、βc(CD122)和γc(CD132)。

IL15主要由树突细胞和巨噬细胞产生，是重要的促炎症因子，具有多种生物学功能。IL15是NK细胞发育的必需细胞因子，Lodolce等研究发现IL15α缺陷的小鼠多表现为先天免疫缺陷，包括脾脏中NK细胞数量的减少和细胞毒活性的降低；而IL15^-/-表现为脾和肝脏NK细胞缺乏，加入外源性的IL15不仅可以增加脾脏中NK细胞百分比还可以增强NK细胞活性；IL15过表达小鼠中NK细胞的数量有显著的扩增。IL15还是T细胞生长因子；IL15R^-/-小鼠的T细胞在向外周淋巴结归巢的过程中有缺陷，其胸腺和外周中CD8+T细胞数量不足，外源供给IL15小鼠情况好转，IL15是CD8+T细胞扩增和生存的关键；IL15能够维持T细胞CTLL-2生长、诱导细胞毒性T细胞活性、增强T细胞早期活化及增殖。除此之外，IL15对中性粒细胞、B细胞的分化等都具有重要作用。

IL15与IL2的受体共用βc和γc链，通过βγ受体亚单位结合并活化Jak1和化Jak3，导致STAT-3和STAT-5活化并向细胞核定位，诱导bcl-2，活化MAP激酶信号通路，使Lck和和syk激酶磷酸化。因此IL15与IL2有许多相似的生物学功能，例如都能刺激T细胞和NK、LAK细胞的杀伤调节，但IL15/IL15Rα的转录本比IL2/IL12α有更广泛的组织表达，其细胞来源和靶细胞分布也更广泛。

鉴于IL15的重要作用，本领域仍需要动物模型以对IL15进行进一步研究。小鼠与人类基因组非常相似，几乎所有的人类基因都可以在小鼠身上找到同源基因，因此小鼠成为良好的研究人类基因及疾病的动物模型，进一步的免疫缺陷型小鼠是体内研究人类细胞、组织、器官的极好的受体模型，在建立研究人体生物学和临床研究应用方面发挥着重要作用。