[发明专利]用于检测端粒酶活性的引物组及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测端粒酶活性的引物组，包括第一引物组或第二引物组；所述第一引物组包括：上游引物：引物MTS，下游引物：引物ACX‑M4、引物Beacon ACX62‑2C以及引物Beacon ACX62‑10中的任意一种；所述第二引物组包括：上游引物：引物STS或引物CTS，下游引物：引物ACX、引物CXT、引物ACX‑M4、引物Beacon ACX62‑2C以及引物Beacon ACX62‑10中的任意一种；所述引物MTS、引物ACX、引物CXT、引物ACX‑M4、引物Beacon ACX62‑2C、引物Beacon ACX62‑10、引物STS和引物CTS的序列依次如SEQ ID NO:1～8所示。本发明提供的用于检测端粒酶活性的引物组有效防止引物二聚体的形成，采用定量PCR方法检测端粒酶活性可达到单细胞和单个端粒酶分子的检测水平，检测结果线性范围广、灵敏度高且重复性好。

技术领域

本发明涉及检测端粒酶活性技术领域，尤其涉及一种用于检测端粒酶活性的引物组及检测方法。

背景技术

端粒酶是一个逆转录酶，广泛存在于低等单核生物如纤毛虫、酵母到高等脊椎动物如小鼠、人类的细胞中。端粒酶能够在染色体末端延伸六个碱基的重复序列(TTAGGG)，延长端粒长度，从而维持细胞的分裂潜力。研究发现，90％-95％的人永生化细胞株和85％的肿瘤组织中检测到端粒酶活性，在有转移倾向的癌细胞组织中更是能够检测到端粒酶的高表达，而在正常组织细胞中几乎检测不到端粒酶活性，因而端粒酶活性的检测对于癌症的早期诊断有着重要意义。

目前端粒酶活性的检测已经有一些方法，比如端粒酶直接延伸、端粒重复序列扩增法(Telomeric Repeats Amplification Protocol，TRAP)等。TRAP法可以通过电泳检测PCR产物量来定量端粒酶活性，也有报道发现可以用荧光定量PCR方法来做TRAP实验，可以更快更灵敏的检测端粒酶延伸产物。

由于端粒酶延伸后的PCR过程中产生的DNA是大小不一的重复片段，且TRAP实验中一条引物配对区即是重复序列部分，因而TRAP法检测的结果和端粒酶之间无法建立准确的线性关系。

目前已有采用定量PCR的方法检测端粒酶活性。与之前的定量PCR方法不同的是，该种定量PCR方法并不使用SYBR Green I之类的核酸染料，而是通过检测引物末端荧光报告基团的荧光信号来检测PCR产物的变化，当一轮PCR完成后，引物末端上的荧光报告基团会被互补碱基或者互补链上修饰的淬灭基团淬灭。随着PCR反应进行，引物不断被消耗，样品整体荧光信号逐渐降低，样品荧光信号的变化可以实时反映PCR产物量的变化，请参阅图1A和图1B，其中，图1A为端粒酶延伸示意图，图1B为定量PCR反应中下游引物在模板DNA上延伸到末端掺入标记有淬灭基团的碱基后，互补链上的荧光报告基团淬灭。由于本方法中检测PCR产物的信号在引物上，故不论PCR产物多长，一条模板在一轮PCR循环中只能让两个荧光基团发生淬灭。通过样品荧光信号的淬灭曲线可以建立PCR的Ct值和端粒酶数量或者细胞数量的良好线性关系。

但是现有定量PCR方法中因为使用的引物易产生引物二聚体，所以会致使阴性对照样品PCR曲线发生变化的时间过早，其与阳性样品1000个细胞的扩增曲线的差异不够大，使用该PCR系统检测端粒酶活性也不能达到单细胞水平，请参阅图2。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于检测端粒酶活性的引物组，其解决现有方法易形成引物二聚体的技术问题。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种用于检测端粒酶活性的引物组，包括：

上游引物：引物STS或引物CTS，

下游引物：引物ACX；

所述引物ACX、引物STS和引物CTS的序列依次如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.7和SEQID NO.8所示。

进一步地，所述上游引物的5’端均标记有荧光报告基团。