[发明专利]一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法

权利要求书

1.一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：利用κ-卡拉胶酶特异性的将κ-卡拉胶降解为还原糖，将酶灭活后，加入对羟基苯甲酰肼溶液进行显色反应，离心后测定上清液在400-420nm处的吸光值，对比标准曲线得到κ-卡拉胶含量；所述κ-卡拉胶酶为κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：所述κ-卡拉胶酶的最适反应温度为25℃，最适反应pH值为8.0，且在pH 6.0-10.0的pH值范围内基本保持稳定该酶具有良好的贮存稳定性，在4℃下可至少稳定贮存3个月；酶动力学常数Km为0.07mg/mL，Kcat为27.54s^-1，Km/Kcat为165.63μM^-1s^-1。

3.如权利要求1所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：编码上述κ-卡拉胶酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2或可翻译出SEQ ID NO.1的所有基因。

4.如权利要求1所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)κ-卡拉胶溶液的配制：称取化学级或以上纯度的κ-卡拉胶溶于缓冲液，制备具有浓度梯度的κ-卡拉胶标准溶液；

(2)pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于HCl中，然后加入NaOH调溶液pH至碱性，制备成10-100mg/mL的pHBH溶液；

(3)定量标准曲线的绘制：取步骤(1)配制的不同浓度κ-卡拉胶溶液分别与适量的κ-卡拉胶酶液混合进行反应；反应后使酶灭活；再加入pHBH溶液，进行显色，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液的吸光值；将相同浓度梯度的κ-卡拉胶溶液与灭活酶液混合重复上述反应，测定其吸光值作为对照，然后计算出不同浓度κ-卡拉胶溶液所对应的吸光值增量；以κ-卡拉胶标准溶液浓度为横坐标，以各浓度κ-卡拉胶的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线；

(4)样品测定：向样品溶液中加入一定量κ-卡拉胶酶重复步骤(3)的反应；将吸光值增量代入相应加酶量、反应时间、反应温度、反应pH等条件下的标准曲线，计算出反应体系中的κ-卡拉胶浓度，进而可得到样品中的κ-卡拉胶含量。

5.如权利要求4所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：步骤(1)中的缓冲液pH为7.0-10.0。

6.如权利要求4所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：步骤(3)中酶的添加量为1-1000U，反应时间为5-40min，反应温度为20-35℃。

7.如权利要求4所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：步骤(4)测定前按照国标GB5009.88—2014方法，除去样品中的还原糖。