[发明专利]一种酶法定量检测ι-卡拉胶的方法

说明书

本发明涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种酶法定量检测ι‑卡拉胶的方法。利用ι‑卡拉胶酶特异性的将ι‑卡拉胶降解为还原糖，将酶灭活后，加入对羟基苯甲酰肼溶液进行显色反应，离心后测定上清液在400‑420nm处的吸光值，对比标准曲线得到ι‑卡拉胶含量。本发明检测方法线性范围好，准确度高，可在市场中推广使用。

技术领域

本发明涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种酶法定量检测ι-卡拉胶的方法。

背景技术

卡拉胶(carrageenan)又称为鹿角菜胶或角叉菜胶，是从角叉菜、麒麟菜、杉藻等红藻的细胞壁中提取的天然阴离子硫酸线性多糖，根据结构中半乳糖上硫酸基的数量与连接位置以及3，6-脱水半乳糖的含量的不同，卡拉胶具有多种类型。ι-卡拉胶是三种常见卡拉胶类型(κ-、ι-和λ-卡拉胶)之一，它由交替的硫酸化-α-D-3,6-脱水半乳糖和硫酸化-β-D-半乳糖残基组成，因来源广泛，功能多样而被应用于食品、药品、化妆品等多项工业生产中，发挥凝固剂、粘合剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂等作用。

ι-卡拉胶的定量检测是ι-卡拉胶质量控制、功能研究、产品开发中的基础环节。目前，常用的ι-卡拉胶定量检测方法是苯酚-硫酸法和液相色谱-串联质谱法等。苯酚-硫酸法灵敏度高，且不需贵重仪器，但易受样品中其他多糖的影响，且耗费时间，样品和试剂消耗较多。液相色谱-串联质谱法通过对样品进行水解、衍生及预处理，通过测定ι-卡拉胶组成单糖的含量合计得到ι-卡拉胶含量，该方法灵敏度高、准确性好，但仪器成本高、操作繁琐。

对羟基苯甲酰肼(pHBH)是一种芳香族酰肼类化合物，在强碱性条件下能与β-二酮类化合物生成黄色产物。有研究表明，pHBH在高温及碱性条件下，可与葡萄糖等还原糖反应产生相似的黄色物质，反应后颜色深浅与还原糖浓度成正比，且该反应的灵敏度较高。这就为酶法定量检测ι-卡拉胶提供了可行性。

综上所述，找到一种灵敏度高、准确性好、操作简便的ι-卡拉胶定量检测方法具有重大的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是常用的ι-卡拉胶定量检测方法是苯酚-硫酸法和液相色谱-串联质谱法，但这两种方法分别具有重现性差和操作繁琐、费时费力的缺点，不能实现灵敏度高、准确性好、操作简便的检测。

为解决上述问题，本发明提供一种酶法定量检测ι-卡拉胶的方法，利用特异性的ι-卡拉胶酶，特异性的将ι-卡拉胶降解为还原糖，利用对羟基苯甲酰肼(pHBH)的显色反应，通过测定400-420nm处的吸光值，测定ι-卡拉胶的含量。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：一种酶法定量检测ι-卡拉胶的方法，利用ι-卡拉胶酶特异性的将ι-卡拉胶降解为还原糖，将酶灭活后，加入对羟基苯甲酰肼溶液进行显色反应，离心后测定上清液在400-420nm处的吸光值，对比标准曲线得到ι-卡拉胶含量。

进一步的，所述ι-卡拉胶酶为ι-卡拉胶酶Cgi1_Wf，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。因为目前在GH82家族ι-卡拉胶酶的研究中，目前大多数酶稳定性差，失活快，实际应用时具有很大的局限性，降解ι-卡拉胶不完全不可控，会导致较大的实验误差。

SEQ ID NO.1：