[发明专利]生物碱cyanogramide的生物合成基因簇及其应用

说明书

本发明公开了生物碱cyanogramide的生物合成基因簇及其应用。本发明的来源于放线菌A.cyanogriseus WH1‑2216‑6(保藏编号为：CCTCC NO:M 2009277)的cyanogramide生物合成基因簇，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第393～13440位的碱基序列所示，包含10个基因；其中的P450氧化酶基因cyaH，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第10626～11843位的碱基序列的反向互补序列，编码P450氧化酶CyaH，其能以Fdx、Fdr和NADPH为辅因子催化cyanogramide D通过骨架重排生成cyanogramide。本发明所提供的包含cyanogramide生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解cyanogramide家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种氧化吲哚螺环生物碱类化合物cyanogramide的生物合成基因簇及其应用。

背景技术：

Cyanogramide(图1中的1)是从一株浅蓝异壁放线菌Actinoalloteichuscyanogriseus WH1-2216-6的培养物中分离得到，属于生物碱类化合物，具有独特的氧化吲哚螺环结构。Cyanogramide(1)具有逆转肿瘤细胞抗性的活性，相应的机理正在深入研究中。

近十多年来发展起来的组合生物合成技术为改造复杂天然产物提供了新的思路和方法。在阐明了自然界的生物合成途径、克隆和鉴定微生物天然产物生物合成基因簇的基础上，采用组合生物合成技术对发现的生物合成基因进行缺失、重组和异源表达，不但能够生产“非天然”的天然产物结构类似物，而且还可以提高天然产物的产量，或定向积累所需要的天然产物，为天然产物的发现和药物开发提供分子和活性多样性。

迄今为止，关于cyanogramide(1)生物合成基因簇克隆鉴定，构建重组菌株产生cyanogramide(1)及同系物，以及cyanogramide(1)结构中螺环的形成机制等国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种生物碱类化合物cyanogramide(1)的生物合成基因簇，其来源于浅蓝异壁放线菌A.cyanogriseus WH1-2216-6。

本发明的cyanogramide(1)的生物合成基因簇，其特征在于，该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第393～13440位的碱基序列所示，包含10个基因，具体为：

(1)负责β-咔啉碱骨架合成的基因，即cyaA、cyaB和cyaC共3个基因：

cyaA位于基因簇核苷酸序列第393-1946个碱基处，长度为1554个碱基对，编码脂肪酸CoA连接酶，517个氨基酸；

cyaB位于基因簇核苷酸序列第3455-4399个碱基处，长度为945个碱基对，编码Pictet–Spengler环化酶，314个氨基酸；

cyaC位于基因簇核苷酸序列第4420-6111个碱基处，长度为1692个碱基对，编码脱羧酶，563个氨基酸；

(2)负责甲基化基因，即cyaD、cyaE和cyaF共3个基因：

cyaD位于基因簇核苷酸序列第6159-7190个碱基处，长度为1032个碱基对，编码甲基转移酶，343个氨基酸；

cyaE位于基因簇核苷酸序列第7226-8008个碱基处，长度为783个碱基对，编码甲基转移酶，260个氨基酸；

cyaF位于基因簇核苷酸序列第8583-9311个碱基处，长度为729个碱基对，编码甲基转移酶，242个氨基酸；