[发明专利]一种骨骼肌细胞模型的构建方法和测定方法

权利要求书

1.一种骨骼肌细胞模型的构建方法，其特征在于，所述骨骼肌细胞模型的构建方法包括以下步骤：

步骤一，复苏L6成肌细胞、ANPC细胞，进行L6成肌细胞、ANPC细胞体外原代、传代培养，并利用显微镜对培养过程中的细胞进行细胞形态学观察及分析；

步骤二，L6成肌细胞分化第8天，用100μMAICAR 0.1％DMSO处理0、3、6、12小时后收集细胞培养基，采用western-blot分析，用100μM的AICAR处理的培养基中的CTSB蛋白水平增加；

步骤三，通过银染蛋白质组学分析、质谱分析候选蛋白的肽序列，估计蛋白质大小确定候选序列；

步骤四，通过QSPEC、分泌数据库、运动微阵数据集和AICAR处理的微阵数据集，选择具有细胞外功能的37kda CTSB，验证AICAR对体外L6成肌细胞分泌CTSB水平的影响，确定AICAR处理后培养基中CTSB的水平变化；

步骤五，测量小鼠运动后体内CTSB水平，验证骨骼肌细胞运动模型的可行性，进行骨骼肌细胞模型的构建。

2.如权利要求1所述的骨骼肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述L6成肌细胞原代培养方法具体包括：

(1)准备1支15mL离心管，管中加9mL对应培养基，从-80℃液氮罐中取出L6成肌细胞，在37℃水浴锅中复苏小鼠L6成肌细胞1分钟左右，将细胞悬液转移离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；离心管加DMEM培养基1mL重悬细胞，用细胞计数仪计数；

(2)将浓度以1*10⁵/mL密度接种于100mm培养皿中培养，培养皿中加1mL胎牛血清和9mLDMEM培养基，细胞放置在5％CO₂、37℃培养箱培养。

3.如权利要求1所述的骨骼肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述L6成肌细胞传代培养方法具体包括：

首先，水浴锅37℃预热配制好的完DMEM加10％牛血清的全培养基、PBS、胰酶，用10mL移液管吸取培养皿中培养基，加2mL胰酶消化细胞2分钟，加5mL培养基终止细胞消化；

其次，用移液枪轻轻吹打细胞，使贴壁细胞脱落；

然后，准备一支15mL离心管，细胞1000rpm离心5min，弃上清；

最后，按1:3比列传代新100mm培养皿中，每皿加10mL培养基，细胞放置在5％CO₂、37℃培养箱培养。

4.如权利要求1所述的骨骼肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述ANPC细胞的原代、传代培养方法具体包括：将复苏的ANPC细胞接种于100mm培养皿中培养，加含有加1mL胎牛血清和9mLNeurobasal medium培养基，另外加200μLB27补充剂，100μL L-谷氨酰胺，20μL EGF，20μLbFGF和20μL肝素中生长，细胞放置在5％CO₂、37℃培养箱培养24小时后细胞进行换液，细胞扩增后进行传代，定时换液并观察细胞形态补加营养因子。

5.如权利要求1所述的骨骼肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤二中，所述100μMAICAR处理细胞方法包括：

第一步，配制75mM AICAR溶液：取一支15mL离心管，加入10mL DMSO，电子天平称取0.194gAICAR溶于DMSO中，用涡旋仪震荡混匀；

第二步，AICAR溶液终浓度是100μM，用移液枪取13.3μL配制好的75mM AICAR溶液加入100mm培养皿中，用十字法将培养液混匀放置5％CO₂、37℃培养箱培养；

第三步，取5支1.5mL离心管每支收取0、3、6、12、24小时细胞培养基1mL，测其CTSB蛋白水平。