[发明专利]桃果实酸性转化酶抑制基因PpINH1、编码蛋白及其克隆方法和应用

说明书

本发明公开了桃果实酸性转化酶抑制基因PpINH1、编码蛋白及其克隆方法和应用，特点是桃果实酸性转化酶抑制基因PpINH1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；桃果实酸性转化酶抑制基因PpINH1编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，克隆方法，包括如下步骤：（1）提取桃果实总RNA并反转录成cDNA作为模板；（2）根据PpINH1的基因序列设计引物；（3）PCR扩增：通过PCR扩增得到PpINH1基因扩增产物，优点是可有效抑制酸性转化酶活性，降低蔗糖。

技术领域

本发明涉及酸性转化酶抑制基因，尤其是涉及桃果实酸性转化酶抑制基因PpINH1、编码蛋白及其克隆方法和应用。

背景技术

桃果实肉细汁多，风味鲜美，广受欢迎，但桃是呼吸跃变型果实，采后呼吸强度的快速增加会加快其成熟和衰老，导致其货架期短，风味下降快。低温可以延长果实的贮藏保鲜期，然而桃属于冷敏型果实，贮藏温度低于8℃ 时易出现冷害症状，如果肉褐变、絮败、风味改变等，从而贮藏期缩短，甚至失去食用价值。

作为桃成熟过程中的主要糖分，蔗糖不仅与果实口感和风味密切相关，还影响采后桃果实的品质和抗冷性。低温胁迫下的桃果实蔗糖快速下降，伴随着严重冷害的发生；抑制蔗糖的下降，有利于减轻冷害。转化酶作为蔗糖代谢中的关键酶之一，催化蔗糖不可逆地分解成果糖和葡萄糖。根据其最适pH，转化酶可分为酸性转化酶（AI）和碱性转化酶（或中性转化酶，NI）。 酸性转化酶被认为是果实蔗糖代谢中最重要的酶，控制果实中糖的组成并影响应激反应。根据其亚细胞定位，酸性转化酶可进一步细分为两类：细胞壁型转化酶（CWIN）和液泡酸性转化酶（VIN），也称为可溶性酸转化酶（SAI）。

在桃果实酸性转化酶基因家族成员中，液泡酸性转化酶（PpVIN2）对低温胁迫敏感，在低温胁迫条件下该基因表达量上升几十甚至数百倍，在蔗糖分解、冷害发生中发挥重要作用。值得关注的是，PpVIN2在低温胁迫下转录水平上升倍数与其酶活性的上升不成比例，推测可能存在抑制子（INH）参与的翻译后调控，即可能存在抑制子蛋白与液泡酸性转化酶PpVIN2相复合，抑制其活性。

1961年 Schwimmer等发现马铃薯中存在内源蛋白可以抑制转化酶活性，称为转化酶抑制子。三十多年后Greiner等首次从烟草悬浮细胞中克隆编码了内源蛋白抑制子的基因序列。至今在甜菜，马铃薯，番茄，烟草，玉米，野生茄，木薯，甘蔗等多种植物中被发现，其中部分物种的抑制子INH已经被鉴定。INH主要在翻译后水平对转化酶活性进行调控，仅在pH值呈酸性时，才能与植物转化酶形成稳定的复合物来抑制转化酶活性。但在桃果实甚至其它蔷薇科植物果实中却未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可有效抑制酸性转化酶活性，降低蔗糖的分解的桃果实酸性转化酶抑制基因PpINH1、编码蛋白及其克隆方法和应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种桃果实酸性转化酶抑制基因PpINH1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

2、上述桃果实酸性转化酶抑制基因PpINH1编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

上述桃果实酸性转化酶抑制基因PpINH1的克隆方法，包括如下步骤：

（1）提取桃果实总RNA并反转录成cDNA作为模板；

（2）根据PpINH1的基因序列设计引物：上游引物序列：5´-AGCCAATGCAGGGTTTACTTG-3´，下游引物序列：5´-GGAGAGCTGCTTGAAAAACC-3´，引物两端分别包含酶切位点BamHI和XhoI；

（3）PCR扩增：通过PCR扩增得到PpINH1基因扩增产物。

上述桃果实酸性转化酶抑制基因PpINH1在制备桃果实酸性转化酶PpVIN2抑制剂方面的应用。