[发明专利]菜豆凝集素检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种菜豆凝集素检测试剂盒，所述的试剂盒含有菜豆凝集素卵黄抗体，该抗体可以特异性识别菜豆凝集素PHA‑E及PHA‑L两种亚基。本发明利用酶联免疫法定量检测菜豆凝集素的含量，克服了现有检测方法存在的菜豆凝集素的漏检、检测结果容易受凝血或抗凝血成分影响的不足。

技术领域

本发明属于植物活性成分检测技术领域，具体涉及一种用于定量检测菜豆凝集素的检测试剂盒。

背景技术

菜豆又叫四季豆、扁豆、芸豆等，是我国主要蔬菜，多数地区春秋两季栽培。由于进食贮存过久或烹调不当的四季豆，如水焯后做凉菜，或炒食时不够熟透而未能充分灭活凝集素造成中毒，中毒事件多发生在集体食堂，据报道，菜豆中毒主要是由菜豆凝集素导致，菜豆凝集素是由4个分子量约30kD的亚基组成，分子量大小在128KD左右。菜豆凝集素亚基分别为红细胞凝集素(PHA-E)和白细胞凝集素(PHA-L)，红细胞凝集素有强红细胞凝集活性，白细胞凝集素具有强白细胞凝集活性。菜豆中毒最重要的因素是由于菜豆凝集素中的红细胞凝集素可与红细胞表面特异糖基识别并专一性结合，使红细胞发生凝集，白细胞凝集素也会特异性结合白细胞，使其发生凝聚，进而引起机体的整体反应。不同菜豆品种中，由于品种、产地、种植季节的不同，使不同菜豆中凝集素的含量不尽相同，因此快速检测菜豆凝集素的活性，对低毒品种菜豆的选育提供指导。

现有菜豆凝集素检测方法都是通过凝集素亚基中红细胞凝集素(PHA-E)的红细胞凝集实验来检测的。该方法一般利用兔红细胞，配制成一定浓度的红细胞悬液，将凝集素溶液经过稀释后加入红细胞悬液中，静置一段时间后，利用肉眼观察血细胞凝集效果的定性分析；或者以分光光度计及酶标仪测定的特定波长下吸光度的半定量分析方法。这些分析方法存在两个重要的问题：第一，菜豆凝集素是由PHA-E、PHA-L亚基形成的四聚体，主要有5种形式：L4、L3E1、L2E2、L1E3、E4，而红细胞聚集实验时，只能检测含PHA-E亚基的四聚体，L4不含可以聚集红细胞的PHA-E亚基，不参与血细胞凝集反应，另外，血细胞聚合只有两个或以上PHA-E亚基结合红细胞才能聚合，E1L3四聚体对血细胞凝集反应也不敏感，因此现有检测方法无法检测L4、E1L3四聚体，检测结果只反应E4、E3L1、E2L2三种四聚体含量，不能反应L4、E1L3两种四聚体真实含量，因此，并不能真实反应几种四聚体的真实含量；第二，红细胞凝聚检测方法中的红细胞每次需要新鲜取兔子血，血液在冰箱保存最多只能两周，因此要长期饲养兔子，而且每次使用前都需要把破裂的红细胞洗去，并在显微镜下调整细胞浓度，因此使用起来非常麻烦；第三，红细胞凝集实验是非特异性的凝血实验，因此，实验过程中还会受到其它凝血物质或抗凝血物质的干扰；第四，红细胞聚集实验肉眼定性实验中结果判断主观性强，分光光度计及酶标仪方法需要专业实验室和人员才能操作。

针对现有菜豆凝集素检测存在的缺陷，我们制备了针对菜豆凝集素的卵黄抗体，抗体可特异性识别菜豆凝集素PHA-E及PHA-L两种亚基，因此5种形式L4、L3E1、L2E2、L1E3、E4均可以被特异性识别。此外，检测过程不需要用到红细胞，试剂可长期保存，检测质量不会随红细胞质量改变或者其它而受到影响。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种菜豆凝集素定量检测试剂盒，利用菜豆凝集素卵黄抗体特异性识别菜豆凝集素，特异性强，准确度高。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种菜豆凝集素检测试剂盒，所述的试剂盒含有菜豆凝集素卵黄抗体和酶标记的兔抗鸡IgY，还包括酶标板、菜豆凝集素标准样品溶液、封闭液、洗涤液、底物显色液和终止液。

进一步地，所述的菜豆凝集素卵黄抗体的制备方法如下：

(1)菜豆凝集素标准品免疫鸡后，收集鸡蛋，去蛋清留蛋黄；

(2)用硫酸铵沉淀法粗提菜豆凝集素卵黄抗体；

(3)用离子交换柱层析法纯化卵黄抗体。