[发明专利]具有去除宿主基因组DNA功能的微生物核酸提取方法以及试剂盒

说明书

本发明公开了具有去除宿主基因组DNA功能的微生物核酸提取方法以及试剂盒。本发明提供了成套引物对，包括1个或多个引物对，每个所述引物对对应扩增宿主基因组DNA中的1个高度重复序列；所述高度重复序列任选自如下基因家族中至少一种基因，所述基因家族包括MIR家族基因和/或ALu家族基因。本发明提供的具有去除宿主基因组DNA功能的微生物DNA提取方法富集微生物基因组DNA效果更强，本发明是在裂解释放核酸步骤后去除宿主基因组DNA，然后再富集微生物基因组DNA进行纯化回收，同时还可以富集宿主细胞内部的病毒核酸，不改变宏基因组菌群结构。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种具有去除宿主基因组DNA功能的微生物核酸提取方法以及试剂盒。

背景技术

宏基因组学(Metagenomics)又叫微生物环境基因组学、元基因组学，它主要是通过直接从环境样品中提取全部微生物的基因组DNA构建基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能，随着新一代测序技术的迅猛发展，宏基因组学的研究已经应用到各个领域，近几年尤其是在临床医学领域包括感染性疾病诊断、病原药敏、传染病疫情、流行病学等，有力推动感染性疾病精准医学发展，提高临床感染性疾病诊疗水平。

当前在利用高通量测序在面对复杂临床样品如感染血液、唾液和呼吸道样本时，由于微生物基因组相对于宿主人的基因组小太多，如果采用传统的核酸提取方法进行基因组核酸提取纯化时，提取得到微生物基因组在提取得到的总核酸中所占比例很小，仅占到1％-6％,测序得到的Reads数大部分为宿主人的基因组序列，为提高病原体基因组足够的序列覆盖度，往往需提高测序的深度，造成了大量的不必要的测序数据浪费，这也是目前临床上未知病原检测成本居高不下的主要原因。

目前市面上针对于血液、唾液、咽拭子等临床样品的微生物核酸的提取方法主要包括磁珠法、吸附柱法和传统的酚/氯仿抽提法，这些方法和试剂盒大部分不具备去除宿主基因组DNA的功能，只有少数几款产品和专利涉及到了去除宿主基因组DNA功能。Qiagen公司提供一款细菌基因组DNA提取试剂盒，即QIAamp DNA Microbiome Kit，该产品采用化学和物理方法裂解细胞，可以从拭子和体液中纯化和富集细菌微生物DNA，在纯化的过程中高效的去除宿主DNA，适用于基于16s让DNA的高灵敏度微生物组分析和宏基因组鸟枪法测序。广州美基生物科技有限公司有一款针对于血液样品细菌DNA提取试剂盒(货号：D3148-02)，该产品同样是基于化学试剂针对于微生物与宿主细胞之间的渗透压差的原理差异性的裂解宿主细胞释放宿主DNA，实现宿主基因组DNA与微生物基因组之间的分离。2014年中国科学院北京基因组研究所与北京大学人民医院授权了一篇专利《宏基因组提取方法》(专利授权号：CN103060309B)，该专利公开了一种利用探针杂交磁珠捕获方式降低宿主宏基因组DNA样品中的宿主DNA的方法，该方法主要是利用宿主DNA中重复序列Alu序列作为单向或双向探针，利用生物素修饰探针和使用包被链霉亲和素的磁珠捕获与探针杂交的宿主DNA，从而达到减弱宏基因组中宿主DNA背景、提高测序数据有效率的目的。

但是Qiagen公司的QIAamp DNA Microbiome Kit与美基生物的血液中富集细菌DNA提取试剂盒(D3148-02)都是化学试剂优先裂解和释放宿主基因组DNA的原理实现去除宿主基因组DNA的目的，但是由于细菌种类的多样性，很难保证化学试剂释放宿主基因组DNA时对样本中微生物群落结构不产生影响，同时样本中的DNA病毒和RNA病毒等微生物大部分是以整合到宿主基因组中或游离在宿主细胞质的形式存在，在去除宿主基因组DNA的同时将病毒基因组DNA和RNA一并去除。该方法不能提取样本中病毒DNA和RNA，使得这类产品在宏基因组研究中往往漏检病毒类病原体，实用性大打则扣，因此仅仅利用化学方法和物理方法很难实现去除宿主基因组DNA的同时将宏基因组DNA全部保留的目的。