[发明专利]涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法及波导孔结构

说明书

本发明提供一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，该方法通过调节高折射率非反射层的沉积厚度可以缩小零模波导孔的孔内体积，显著减少孔内的游离核苷酸，提高信噪比；通过在孔内部沉积高折射率非反射层材料可以使被激发荧光的位置远离零模波导孔的金属壁，使荧光不会减弱甚至淬灭，荧光效果增强的同时也使得检测更加灵敏；选取设定的高折射率非反射层材料以及沉积厚度(即控制孔内样本与非反射壁的折射率)可以在增强荧光与保证酶活性之间获得最佳平衡；通过使用掩模版和正胶的光刻可以使每个零模波导孔中心底部精确的连接DNA聚合酶，提升孔的利用率。本发明还涉及一种涂覆有锚定物质的零模波导孔结构。

技术领域

本发明涉及微纳加工工艺领域，尤其涉及一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法。

背景技术

目前利用零模波导孔(ZMW)实现单分子实时测序，两个主要技术成分是：一是零模波导(ZMW)限制允许在与酶相关的标记核苷酸浓度下进行单分子检测，另一个是荧光标记的磷酸连接核苷酸，允许观察不间断的DNA聚合。

ZMWs纳米结构由密集的孔阵列组成，在透明衬底(例如二氧化硅)上沉积金属膜。每个ZMW变成一个纳米光子可视化室，用于记录单个聚合反应，提供的检测体积仅为10^-21升。这个体积比衍射限制共焦显微镜提高1000倍，使得在荧光标记核苷酸扩散的背景下观察单核苷酸掺入事件成为可能。除了减少观察体积内标记核苷酸的数量外，高度受限的体积还导致扩散探视时间大大缩短。这使得通过观察体积(通常持续几微秒)的标记核苷酸扩散事件和酶核苷酸掺入事件(通常持续几毫秒)之间更好的时间区分。第二个重要组成部分是磷酸连接核苷酸，其荧光标签通常通过连接体连接到末端磷酸盐而不是碱基。用磷酸连接的核苷酸100％取代未修饰的核苷酸，这是因为酶在结合过程中分解荧光团，留下一个完全天然的双链核酸。

但是在测序的过程中孔内游离的核苷酸较多，对荧光信号检测产生干扰、信噪比低；荧光在被激发时越靠近金属孔壁产生的效果越弱，当完全靠近时会发生荧光淬灭。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法。

本发明通过使用掩膜版与正胶的光刻使每个零模波导孔的底部精确连接DNA聚合酶，提升孔的利用率。

本发明提供一种涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法，包括如下步骤：

在所述零模波导孔的孔壁上覆盖高折射率非反射材料，所述高折射率非反射材料用于减小所述零模波导孔的孔内体积；

在所述高折射率非反射材料的表面以及所述零模波导孔的底部涂覆正性光刻胶，且在所述零模波导孔的衬底底部通过叠加掩膜版进行曝光，所述掩膜版与所述零模波导孔的底端相对应的位置镂空，以使得涂覆于所述零模波导孔的底端处的所述正性光刻胶在显影后溶解，记为第一区域；

在所述零模波导孔的内壁涂覆锚定物质，所述锚定物质用于吸附待测样本中的DNA聚合酶；所述锚定物质涂覆于所述正性光刻胶的表面以及填充所述第一区域；通过剥离的方式将所述正性光刻胶与其表面的所述锚定物质去除，以使得所述第一区域的所述锚定物质保留于所述零模波导孔的底部。

优选地，在所述零模波导孔的孔壁上覆盖高折射率非反射材料，包括的方法如下：

在所述零模波导孔的内部涂覆负性光刻胶，从所述零模波导孔的透明衬底侧进行光照射，位于所述零模波导孔底端的所述负性光刻胶曝光且其他区域未曝光；显影后所述零模波导孔底端的所述负性光刻胶保留；

在所述零模波导孔的内部覆盖所述高折射率非反射材料，所述高折射率非反射材料覆盖于所述负性光刻胶的表面；

通过剥离的方式将所述负性光刻胶以及表面的所述高折射率非反射材料一同去除，获得孔壁上覆盖有所述高折射率非反射材料的所述零模波导孔。