[发明专利]一种磷脂酰丝氨酸的纯化方法

说明书

本发明公开了一种磷脂酰丝氨酸的纯化方法，将酶解反应获得的脂溶性杂质含量低于30％的磷脂酰丝氨酸置于水中得到磷脂酰丝氨酸水溶液，调节水溶液的温度为5‑15℃，水溶液经乳化剪切、离心得到含量为至少70％的磷脂酰丝氨酸。本发明纯化磷脂酰丝氨酸的方法只使用水，不使用有机溶剂，即可制备磷脂酰丝氨酸含量大于70％的产品，克服了传统方法只有使用有机溶剂纯化才能制备高含量磷脂酰丝氨酸产品的不足，并且有机溶剂纯化后需加热浓缩收集磷脂酰丝氨酸，此过程易导致磷脂酰丝氨酸产品过氧化值升高，只用水的纯化过程即克服了这一缺点。

技术领域

本发明涉及一种纯化方法，尤其涉及一种磷脂酰丝氨酸的纯化方法。

背景技术

磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)，是细胞膜重要的组分之一，广泛存在于所有动物、高等植物以及微生物的膜中，它是唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能状态的磷脂。其主要功能是提高脑活力，治疗脑萎缩、改善老年人的大脑功能预防老年痴呆症；修复大脑损伤，治疗儿童多动症；促进脑疲劳的恢复，平衡情绪，缓解抑郁；调高大脑信号传导速率，有助于改善记忆力、认知能力，提高学习成绩。2007年PS通过了美国FDA认证，2010年我国卫生部第15号公告公布PS为新资源食品。

目前，PS的主要制备方法是酶转化法，即磷脂酶D催化磷脂和L-丝氨酸发生转磷脂酰基反应生成PS。现有酶转化法制备磷脂酰丝氨酸有两种方式，即有机相-水相双相法和单一水相法。由于PS主要用于食品中，有机溶剂的使用对人体仍会带来一定的危害，因此应用纯水系的反应方法来制备PS较为广泛。磷脂酶D既有水解活性又有转移活性，目前发现的磷脂酶D大多具有较高的水解能力，只有少数具有较高的磷酰基转移能力。因此为了抑制水解反应，酶反应体系中添加了过量的底物L-丝氨酸，这些过量的丝氨酸会混合在PS产品中，降低PS的含量；并且酶转化生成的磷脂酰丝氨酸时还会产生一些副产物，因此需对其进行纯化提高含量，而目前的纯化过程均使用了有机溶剂，如乙酸乙酯、石油醚、正己烷、氯仿或乙醇等有机溶剂，需要通过浓缩来获得有机溶剂中的磷脂酰丝氨酸，并且使用有机溶剂的生产过程具有危险性，存在安全风险，回收过程能耗大，对环境也会造成一定污染。

发明内容

发明目的：本发明旨在提供一种不使用有机溶剂的磷脂酰丝氨酸的纯化方法，解决现有技术使用有机溶剂带来的危险性问题和产品安全性问题。

技术方案：本发明磷脂酰丝氨酸的纯化方法，将酶解反应获得的脂溶性杂质含量低于30％的磷脂酰丝氨酸置于水中得到磷脂酰丝氨酸水溶液，调节水溶液的温度为 5-15℃，水溶液经乳化剪切、离心得到含量为至少70％的磷脂酰丝氨酸。

本申请磷脂酰丝氨酸与水的质量比为1:4-6。研究发现，酶解制备磷脂酰丝氨酸的过程中，为抑制水解副反应的发生，添加了大量的丝氨酸，导致生成的磷脂酰丝氨酸中有丝氨酸残留，从而影响磷脂酰丝氨酸的含量。为此，本申请用过量的水(例如使用磷脂酰丝氨酸质量4-6倍的水)溶解残留的丝氨酸，从而提高磷脂酰丝氨酸的含量。

值得提及的是，本发明酶解反应获得的磷脂酰丝氨酸是通过水相的反应体系，以大豆卵磷脂为反应底物，加入L-丝氨酸和钙盐，在磷脂酶D的作用下生成，其中，所述磷脂酶D是通过镍离子层析柱纯化酶液获得，所述酶液是由产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌发酵制得。本发明所使用的枯草芽孢杆菌，为通过生物技术手段重组构建的可高效表达磷脂酶D的菌株，通过镍离子层析柱纯化可提高磷脂酶D的含量，提高转化率，使用该酶转化大豆卵磷脂生成的磷脂酰丝氨酸在水溶液中稳定，不发生水解反应，因此适用于水溶液进行纯化。

磷脂酶D的制备方法是将重组枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，在36～38℃，150～200rpm条件下培养6～12h，至对数生长期，将种子液转移至发酵培养基中，在 36～38℃，150～200rpm条件下继续培养40～50h，获得酶液。该磷脂酶D具体的制备方法参见合作单位江南大学的发明专利，名称为“一种产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌及其应用”，专利号为CN 109456929A。