[发明专利]一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法

说明书

本发明公开了一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，属于植物生物技术领域。以田菁黄化苗为材料，优化操作后获得的田菁组织提取液通过调整后的转速离心去除杂质，分离并富集粗制的线粒体，经过蔗糖梯度离心法对线粒体进行纯化，再次通过离心富集纯化后的线粒体。利用改良后的SDS法提取的线粒体DNA其A260/A280约为1.80～1.88，限制性内切酶EcoR I酶切后条带清晰，说明本方法提取的线粒体DNA纯度高。利用该发明所公开的方法能够简单快捷的提取到纯净的田菁线粒体DNA，为田菁线粒体基因组及其内部基因的分子机理研究奠定了基础。

一、技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及田菁线粒体及其DNA的有效提取方法，适用于田菁线粒体及其DNA的分离纯化。

二、背景技术

线粒体是半自主细胞器，在真核生物中，通过氧化磷酸化过程为细胞提供ATP。线粒体基因组具有进化缓慢、序列插入缺失频繁、重组迅速、结构复杂多样和基因表达模式独特等特点(Schuster and Brennicke 1994；Sanchez Puerta et al.2017；Kovar etal.2018；Sanchez Puerta et al.2019；Zhang et al.2019)。植物线粒体基因组的大小变化范围较大，从187kb到2400kb均有分布(Bentolila and Stefanov，2012)。线粒体与细胞核、质体之间的序列交换及其自身重复序列的含量对线粒体基因组大小影响很大(Sternand Lonsdale 1982；Vaughn et al.1995；Goremykin et al.2012；Christensen 2014；Wynn and Christensen 2019)。植物在有氧呼吸过程中，葡萄糖通过糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化在线粒体中释放能量。但在无氧环境中，细胞则会在细胞质基质中进行无氧呼吸，糖酵解产生的丙酮酸不再进入线粒体进行三羧酸循环。除了合成ATP为细胞提供能量等主要功能外，线粒体还能通过调节膜电位控制细胞程序性死亡。

田菁作为一种豆科植物，根系发达，鲜草产量高且养分丰富，已成为一种优良的夏季绿肥和动物饲料(徐开未等，2014；黄志武和廖红1992)。此外，田菁的茎秆纤维可用于造纸，种子可用于生产田菁胶(焦彬等1986)。近期的研究表明，田菁叶片中的新型半胱氨酸酶可能在止血和伤口愈合过程中发挥作用(Shivamadhu et al.2017)。因此田菁具有较高的生态和经济利用价值。据研究发现，田菁在涝胁迫环境中根部能够形成海绵状通气组织，生物量增加，结瘤能力增强。在此过程中田菁根部线粒体的呼吸作用是否受到影响，是否存在种属特异基因响应涝胁迫还未知。田菁线粒体及其高纯度DNA的提取能够为后期研究奠定基础。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是公开一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，该方法适用于田菁线粒体及其DNA的分离纯化。为了获得纯化的线粒体，对田菁种子进行暗培养，以减少叶绿体的产生，通过差速离心法去除植物组织杂质和细胞核，获得粗制的线粒体，采用蔗糖密度梯度和超速离心相结合的方式去除与线粒体沉降系数相近的质体，分离得到纯化的线粒体。想要得到高纯度的线粒体DNA，需要去除细胞核和质体中的DNA还有组织中的RNA。利用差速离心和DNase消化相结合的方式去除游离的和结合在线粒体膜上的DNA。在对纯化的线粒体破壁提取DNA的过程中，RNase的加入和3h的水浴能够很好的去除RNA的干扰。本发明结合不同植物线粒体DNA的提取方法和不断的试验摸索，对组织破碎方式、匀浆缓冲液和DNA提取缓冲液组分、差速离心组合进行了调整，结合蔗糖密度梯度离心法获取高纯度的线粒体及其DNA。本发明具有操作简便，成本低廉，产物纯度高的特点，为田菁线粒体基因组的研究奠定基础。

技术方案

本发明基于试验摸索改良过后的组织匀浆缓冲液组分和差速离心组合，结合蔗糖密度梯度和超速离心获取纯化的线粒体，后经改良的DNA提取缓冲液，实验获得高纯度的线粒体DNA。具体实验内容如下：

1、田菁组织匀浆液的获取：