[发明专利]一种调控多粘菌素B同系物组分的方法

权利要求书

1.一种调控多粘菌素B同系物组分的方法，其特征包括如下步骤：

（1）质粒构建：将对亮氨酸特异性的腺苷酸活化结构域基因、CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的上游500 bp同源臂基因与CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的下游500 bp同源臂基因，通过重叠延伸PCR的方法相连得到的片段，通过BamH I与Sal I双酶切连接到载体pGEMT-Easy，获得载体pT-A，通过BamH I与Sal I双酶切pT-A与pMAD质粒，将酶切片段相连，得到pMAD-△A；

将对6-甲基辛酸、6-甲基庚酸强特异性识别的缩合结构域基因、CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的上游500 bp同源臂基因与CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的下游500 bp同源臂基因通过重叠延伸PCR的方法相连得到的片段，通过BamH I与Sal I双酶切连接到载体pGEMT-Easy获得载体pT-C，通过BamH I与Sal I双酶切pT-C与pMAD质粒，将酶切片段相连， 得到pMAD-△C；

所述对亮氨酸特异性的腺苷酸活化结构域基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的上游500 bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示；

所述CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的下游500 bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示；

所述对6-甲基辛酸、6-甲基庚酸强特异性识别的缩合结构域基因的核苷酸序列如SEQID NO.4 所示；

所述CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的上游500 bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5 所示；

所述CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的下游500 bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6 所示；

（2）菌种构建：将pMAD-△A转化CJX518，通过抗生素和蓝白斑筛选得到转化成功的菌株，再42-45℃ 培养传代得到质粒丢失菌株，通过PCR 测序验证为结构域替换菌株518-A；

再将pMAD-△C转化所述结构域替换菌株518-A，通过抗生素和蓝白斑筛选得到转化成功的菌株，再42-45℃ 培养传代得到质粒丢失菌株，通过PCR 测序验证为结构域替换菌株518-AC；

（3）种子培养：将结构域替换菌株518-AC在种子培养基中培养，得到一级种子；将一级种子在种子培养基中培养，得到二级种子；

（4）多粘菌素B生产：将步骤（3）获得的二级种子按初始OD₆₀₀为0.2的接种量接入发酵培养基中，在转速为180-250 rpm，温度为28-37℃条件下摇瓶发酵72小时。