[发明专利]一种用于生产L-草铵膦的酶组合和L-草铵膦生产方法

说明书

本发明公开了一种用于生产L‑草铵膦的酶组合，包括谷氨酸脱氢酶和辅酶再生酶，所述辅酶再生酶为醇脱氢酶、甲酸脱氢酶和亚磷酸脱氢酶。本发明还公开了一种L‑草铵膦的生产方法，以2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]‑丁酸作为原料，添加NH₄⁺、辅酶NADP⁺/NADPH和辅酶再生底物，然后使用所述酶组合进行催化，其中，谷氨酸脱氢酶用于将2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]‑丁酸催化反应为L‑草铵膦，辅酶再生酶用于将NADP⁺还原为NADPH。本发明提供的酶组合和L‑草铵膦生产方法，所产生的副产物极易去除，简化了产品的后处理工艺、产品总收率大于95％，降低了L‑草铵膦的生产成本，是一种绿色、环保、低碳的工艺路线，适合大规模工业化生产应用。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种用于生产L-草铵膦的酶组合和L-草铵膦生产方法。

背景技术

草铵膦，也称草丁膦，英文名为：Phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸。草铵膦是一种广谱灭生性除草剂。

目前，世界三大除草剂分别为草甘膦、百草枯和草铵膦。草甘膦的长期大量使用，一是造成大量杂草产生抗性，使草甘膦趋于失效；二是造成严重水土流失和土壤板结；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用。草铵膦由于其环境相容度高、几乎没有动物毒性等优点，是草甘膦和百草枯的最佳替代者。更重要的是，随着转基因技术的发展，抗草铵膦作物的种类和种植面积会进一步增多，草铵膦将具备更广阔的的市场前景。

制备光学纯L-草铵膦的方法主要有三种：化学不对称合成法、手性拆分法以及生物催化法。生物催化法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高及产物易分离纯化等优点，是生产L-草铵膦的潜在优势方法。生物催化的不对称合成可以针对分子的手性中心，直接合成单一的光学异构体。这类反应的代表就是酶催化的转氨基反应或酶催化的还原胺化反应，均以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸(PPO)为原料，合成L-2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸(即L-草铵膦)，涉及到的酶分别为转氨酶和谷氨酸脱氢酶。

专利CN1349561A筛选得到了能够特异性地催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的草酰乙酸转氨酶，直接利用L-天冬氨酸为氨基供体。但此工艺效率低下，当底物PPO的浓度为552mmol/L、在几乎完全消耗大约700mmol/L的原料L-天冬氨酸的情况下，只生成251.9mmol/L的产物L-PPT，与此同时生成了大约234.5mmol/L的杂质丙氨酸，原料PPO的转化率只有52％。因此，转氨酶工艺虽然具有酶活高、立体选择性高等优点。但也存在两大缺陷，其一是转氨酶催化的反应为可逆反应，原料PPO不能完全转化为L-PPT，在高达4倍量谷氨酸存在的条件下转化率也只有90％；其二是要使可逆反应向生成L-PPT的方向进行、获得高的转化率，需要3-4倍当量以上的手性氨基酸作为氨基供体，过量的氨基供体残余给L-草铵膦的分离精制带来了很大的麻烦。

专利CN106978453A通过筛选得到了酶活较高的谷氨酸脱氢酶，在额外的辅酶再生体系配合反应下，制备了L-草铵膦，反应液中原料PPO的浓度达到了100mM，转化率高达100％。专利CN110184246A通过基因工程改造、获得了一种酶活更高的谷氨酸脱氢酶突变体，在葡萄糖脱氢酶的配合下制备L-草铵膦，原料PPO转化率99％，L-草铵膦浓度最高达到445mM(80.6g/L)，产品ee值99％。谷氨酸脱氢酶可以直接利用无机氨作为氨基供体、还原胺化原料PPO制备L-草铵膦，无需手性氨基酸作为氨基供体；但谷氨酸脱氢酶催化的反应需要消耗等当量的辅酶，由于辅酶价格昂贵，因此，还需要额外辅酶再生体系。采用以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物的辅酶再生系统。此辅酶再生系统的副产物为葡萄糖酸，而葡萄糖酸与产品L-草铵膦都是溶解度极高的物质，难以将二者予以分离，导致产品后处理工艺复杂、精制成本高。