[发明专利]响应调节因子和其突变体及其在制备维生素B12

说明书

本发明公开一种响应调节因子基因、突变基因及其在制备维生素B₁₂中的应用。在苜蓿中华根瘤菌中过表达的响应调节因子基因和突变基因的基因工程菌，其生产维生素B₁₂的能力得到了大幅提高，具有较大的应用推广价值。

技术领域：本发明属于生物技术领域，具体涉及到响应调节因子和其突变体及其在制备维生素B₁₂中的应用。

背景技术：

维生素B₁₂(VB₁₂)又叫钴胺素，属于咕啉类化合物，是唯一含金属元素的维生素类化合物，是B族维生素发现最晚的大分子有机化合物。根据咕啉环上方的配基(R基团)种类不同，维生素B₁₂可分为：羟基钴胺素，脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。维生素B₁₂参与了大量的生化反应过程包括DNA的合成和调控、脂肪酸的合成、氨基酸的代谢及能力的产生。

由于维生素B₁₂分子结构复杂，化学法人工合成需要消耗大量的人力与物力，而且合成周期长。在合成过程中对操作人员的要求过高，导致不能大量的生产。微生物发酵法目前是生产维生素B₁₂的最廉价的方法，能够大量生产并推广其使用。

目前，国内外针对维生素B₁₂生产菌生物合成维生素B₁₂的研究主要集中在发酵过程优化，主要涉及培养基包括碳氮源和金属离子的优化、甜菜碱的添加、鱼藤酮的添加，工艺条件包括pH和供氧的控制等(程立芳等,不同来源的尿卟啉原III转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素B₁₂的影响.工业微生物，2017，第47卷第3期)。

微生物拥有一系列通过调节自身基因的表达来使生物体适应不同环境的机制。双组分系统由两个基本组分构成：一个是组氨酸激酶(histidine kinase HK)，另一个是响应调节因子 (response regulator RR)。然而，在产维生素B₁₂菌种中哪个响应调节因子影响维生素B₁₂的产量尚未见到报道。

发明内容：

本发明人对前期筛选出的高产维生素B₁₂的苜蓿中华根瘤菌CGMCC NO.9638菌株(CN104342390A)，通过对其进行诱变，获得一株产维生素B₁₂能力提高的诱变菌株。本发明作了进一步研究以发现对产维生素B₁₂能力有影响的基因。经过研究发现一种响应调节因子编码基因和其突变基因，其导入苜蓿中华根瘤菌中过表达，能够提高所述菌的产维生素B₁₂的能力。

首先，本发明提供一种响应调节因子的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列在SEQ ID No.2所示原始序列的基础上具有下述突变：第212位氨基酸替换为V。

优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

其次，本发明提供如述的响应调节因子的突变体的编码基因。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

第三方面，本发明提供响应调节因子编码基因在制备维生素B₁₂中的应用。

具体地，通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达，所述导入的编码基因位于质粒或染色体中。

优选地，所述苜蓿中华根瘤菌具有CGMCC NO.9638保藏号的菌株。

进一步地，所述响应调节因子编码基因编码具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽。

更优选地，所述响应调节因子的突变体编码基因具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。