[发明专利]一种间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白及其单克隆抗体的制备

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白及其单克隆抗体的制备。本发明所述间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。为增强该重组蛋白在原核细胞中的表达效果，本发明运用一段柔性片段(四个甘氨酸)作为连接短肽，将间日疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)抗原的A优势表位和B优势表位序列串联后三次重复，组成一个重组蛋白。本发明还涉及该重组蛋白单克隆抗体的制备，经过免疫、细胞融合及多轮筛选得到单克隆细胞株，纯化单克隆抗体并分别标记荧光微球，正交实验确定最佳单抗配对组合。用该重组抗原免疫制得的单克隆抗体具有高特异性，可用于疟疾感染的早期诊断。

技术领域：本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白、编码该重组蛋白的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的质粒载体、转化含有上述质粒载体的菌株，以及用上述重组蛋白制备单克隆抗体，并应用于疟疾感染的快速诊断。

背景技术：疟疾(malaria)是因疟原虫寄生人体组织而引起的寄生原虫病。临床上以间歇性发冷、发热、肝脾肿大为主要特征。主要包括间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟。间日疟是疟疾的一种类型，为间日疟原虫(Plasmodium vivax)所引起，分别在热带、亚热带和温带等95个国家传播。其特点为每隔48小时反复发作一次，主要表现为先冷后热，出汗后恢复正常，两次发作期间表现正常。疟疾的死亡率较高，其中绝大多数死亡是由恶性疟原虫和间日疟原虫引起的，有研究表明，间日疟反复发作可以导致患者虚弱且引起急性肾衰竭，严重贫血，脑型疟，肝脏功能衰竭等诸多并发症。也有研究表明一些寄生虫对一些抗疟疾药物产生了耐药性，从而使其治疗更加困难。因此，开发灵敏度高，特异性好的快速诊断试剂对于间日疟的控制和治疗有重要意义。

目前，诊断间日疟方法包括厚，薄血膜染色镜检法直接镜检间日疟原虫，骨髓涂片，QBC法、探针技术、PCR技术和免疫学检测方法等。其中，厚，薄血膜染色镜检法是诊断疟疾的传统方法，该法费时费力，需要专业镜检人员，且有研究证明该法对低原虫血症者易漏诊。骨髓涂片法阳性率明显高于直接镜检，但其影响因素较多，操作困难易误诊。QBC法、探针及PCR技术需要特殊设备和试剂，价格较昂贵且十分费时，难以达到早期诊断的目的。

免疫学检测方法因其操作简便，结果易于判定，适用于大量样本现场快速筛查等特点而得到非常广泛的应用。该方法主要是通过制备间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)蛋白的单克隆抗体来实现对疟疾的特异性检测。乳酸脱氢酶(LDH)是一种疟原虫循环抗原，在疟原虫整个红内期均表达，是疟原虫表达最丰富的酶之一。常规用于间日疟原虫蛋白单克隆抗体制备的免疫原是完整蛋白，由于抗原表位氨基酸序列同源性缘故，所制得的单克隆抗体特异性差，可能识别其它蛋白，导致检测结果失真。

发明内容:

有鉴于此，本发明目的是通过优化设计一种间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白并制备其单克隆抗体，用于间日疟特异性识别检测。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：