[发明专利]一种基于二氧化硅的超分辨成像探针的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于二氧化硅的超分辨成像探针及其制备方法和应用，该超分辨成像探针为连接了Alexa Fluor 647染料的二氧化硅纳米粒子，并且其表面偶联了HER2（人表皮生长因子受体‑2）核酸适配体；该探针能靶向识别过表达HER2的细胞外泌体，即对过表达HER2的细胞外泌体进行荧光标记；利用超高分辨率显微镜即可对特异性识别该探针的细胞外泌体进行超分辨光学成像；该探针粒径均一，尺寸较小，定位精度高，闪烁性能优良，适用于基于单分子定位法的超高分辨率光学成像；本发明实现了超分辨成像探针对于外泌体的标记，利用单分子定位显微镜，通过双通道共定位的方式，能够实现对细胞外泌体的准确标记。

技术领域

本发明涉及超分辨成像探针和外泌体标记领域，主要涉及一种基于二氧化硅的超分辨成像探针及其制备方法和应用。

背景技术

传统的光学显微镜因为阿贝衍射极限的限制，一般无法对小于200纳米的微观世界进行成像。近数十年来，在科研工作者的不懈探索下，超分辨成像技术应运而生，我们人类首次能够观察到衍射极限以内的超高分辨率图像。

基于单分子定位的超分辨荧光显微成像(SMLM)包括光激活定位成像(PALM)与随机光学重构超分辨成像(STORM),将有机荧光探针与超分辨光学显微成像技术紧密结合在一起，有机荧光探针为研究其超分辨成像提供了有力的工具。因此,荧光探针的选择与使用在超分辨成像中至关重要，荧光探针的光物理性质直接决定着超分辨成像质量的好坏。设计不同性能的荧光探针可以为不同超精细结构的超分辨成像服务，目前常用的荧光探针已发展到针对具体的细胞器与细胞骨架等的一系列探针。

外泌体是多囊泡体(MVBS)与细胞膜接触融合而释放的纳米级圆形或椭圆形生物活性小囊泡。外泌体有脂质双分子层膜结构,直径在40-100 nm之间,广泛存在于体液中。外泌体在细胞间信息通讯中作用重大,其具有一定的信息携带功能,可以向靶细胞传递生物信息。

由于外泌体尺寸结构小于阿贝衍射极限，且其具有重要的生物功能。因此，利用基于单分子定位法的超高分辨率光学显微，同时制备光稳定性优良、定位精度高的适用于外泌体结构的超分辨成像探针，对于外泌体的生物功能研究将会起重要的推动作用。

发明内容

本发明基于二氧化硅的超分辨成像探针的制备方法及应用，为基于单分子定位（SMLM）法的外泌体超分辨光学成像提供了一种制备方法简易、粒径小且均一、定位精度高、荧光闪烁性和特异性良好的超分辨成像探针，可用于外泌体的荧光靶向标记和光学超分辨定位。

一种基于二氧化硅的超分辨成像探针的制备方法，具体步骤如下：由TEOS（正硅酸乙酯）水解反应制备直径15-20nm二氧化硅纳米小球，向二氧化硅纳米球中加入APTMS（3-氨基丙基三甲氧基硅烷）在表面修饰氨基，然后掺入Alexa Fluor 647（琥珀酰亚胺酯）染料，加入HER2（人表皮生长因子受体-2）核酸适配体溶液以及偶联剂，并在掺了染料的二氧化硅纳米球表面偶联HER2适配体，即可得到超分辨成像探针。掺入的Alexa Fluor 647染料具有荧光闪烁特性，可用于超分辨成像。

作为本发明的进一步改进，具体步骤如下：

（1）将L-精氨酸和水充分混合，向溶液中加入环己烷后水浴加热，再向溶液中加入TEOS并水浴加热搅拌，待反应结束，得到直径15-20nm二氧化硅纳米小球溶液；

（2）将二氧化硅小球溶液离心提纯至无水乙醇中，加入APTMS，摇床反应，得到修饰了氨基的二氧化硅小球溶液；向氨基化后的二氧化硅小球溶液中加入Alexa Fluor 647 NHSester，摇床反应，得到掺入了染料的二氧化硅纳米球溶液；待反应结束后，离心提纯即得到掺入了染料的二氧化硅纳米球；

（3）在步骤（2）所得的掺染料的二氧化硅纳米球中依次加入偶联剂溶液以及HER2适配体溶液，并放于摇床摇晃反应，离心提纯，即可得超分辨成像探针；