[发明专利]一种可视化绿色荧光猪伪狂犬病毒及其构建方法有效
| 申请号： | 201911328787.3 | 申请日： | 2019-12-20 |
| 公开（公告）号： | CN111117974B | 公开（公告）日： | 2022-02-22 |
| 发明（设计）人： | 张桂红;易和友;于之清;马俊 | 申请（专利权）人： | 华南农业大学 |
| 主分类号： | C12N7/01 | 分类号： | C12N7/01;C12N15/869;C12N9/22;C12N15/65;C12N15/12;C12R1/93 |
| 代理公司： | 广州粤高专利商标代理有限公司 44102 | 代理人： | 段卉 |
| 地址： | 510642 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 可视化 绿色 荧光 狂犬病毒 及其 构建 方法 | ||
1.一种可视化绿色荧光伪狂犬病毒的构建方法，其特征在于，在伪狂犬病毒的次要骨架蛋白的Met-1/Gly-2之间插入有荧光蛋白；所述构建方法是利用CRISPR/Cas9技术；
所述方法包括以下步骤：S1 .设计sgRNA靶标序列，并根据其合成互补引物序列，退火后连接入pCRISPR/Cas9载体，得到识别剪切VP24的CRISPR/Cas9质粒pCas9-VP24；S2.以克隆载体为骨架载体，插入伪狂犬病毒VP24的Met-1/Gly-2两端的序列作为左右同源臂，左右同源臂间插入Thr-Thr-Ser-Ala-Thr和EGFP基因，构建重组载体pBSK-UL26-EGFP-UL25；S3.将重组载体pBSK-UL26-EGFP-UL25、伪狂犬病毒和CRISPR/Cas9质粒pCas9-VP24转染PK-15细胞，通过克隆筛选，获得含EGFP标记蛋白的病毒株PRV-VP24-EGFP；步骤S1中，互补引物序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1～2所示；所述左右同源臂间插入Thr-Thr-Ser-Ala-Thr和EGFP基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S2中，具体包括以下步骤：S21 .分别使用核苷酸序列如SEQIDNO.3～4所示和核苷酸序列如SEQIDNO.5～6所示引物，以伪狂犬病毒DNA为模板，扩增同源左臂和同源右臂；S22.使用核苷酸序列如SEQIDNO .7～8所示引物，以携带有EGFP基因的质粒为模板，扩增同源左右臂间插入的Thr-Thr-Ser-Ala-Thr和EGFP基因序列；S23.线性化克隆载体；S24.将S21、S22、和S23的产物混合反应，得到重组载体M-pBSK-UL26-EGFP-UL25。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S24中，将S21、S22、和S23的产物混合的质量比为：50～200：50～200：50～200：25～100g。
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