[发明专利]一种微量、高质量铁皮石斛基因组DNA提取方法

说明书

本发明公开了一种微量、高质量铁皮石斛基因组DNA提取方法，属于生物技术领域。该方法在常规CTAB法提取DNA基础上进行改良，在CTAB裂解细胞前，先进行了一次去多糖次生代谢物的步骤，能有效去除多糖次生代谢物；异丙醇沉淀DNA前先加入1/10体积的5mol/L NaCl，进一步除去多糖，获得高质量的基因组DNA。本发明的方法简便快捷，成本低廉，所得基因组DNA质量优良。

技术领域

本专利属于生物技术领域，具体涉及一种微量、高质量铁皮石斛基因组DNA提取方法。

背景技术

铁皮石斛（Dendrobium candidum Wall. ex Lindl）是兰科石斛属药用植物，其有效成分是石斛多糖和生物碱等。铁皮石斛多糖含量高，许多理化性质与DNA相似，常规CTAB法提取铁皮石斛DNA过程中沉淀DNA时，多糖同时也被沉淀下来，严重影响DNA质量，产量和纯度都无法满足基因工程操作的要求。需要一种简便快捷，高质量的铁皮石斛基因组DNA提取方法。

发明内容

本发明针对上述问题，提供了一种微量、高质量铁皮石斛基因组DNA提取方法。该方法简便快捷，在DNA提取过程中，有效除去铁皮石斛多糖，获得高质量、满足基因工程操作的铁皮石斛基因组DNA。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提取铁皮石斛基因组DNA的试剂，包括以下组分：

溶液A：0.15mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L pH8.0 Tris-HCl，0.2%巯基乙醇（现用现加）；

溶液B：2%CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L pH8.0Tris-HCl，0.2%巯基乙醇（现用现加）；

溶液C：氯仿：异戊醇体积比为24：1；

溶液E：5mol/L NaCl；

溶液F：异丙醇；

溶液G：75%酒精；

溶液H：10 mmol/L的pH7.4Tris-HCl，1 mmol/L EDTA。

溶液A、B、E、H经高压灭菌后使用。

一种利用上述提取铁皮石斛基因组DNA的试剂提取铁皮石斛基因组DNA的方法，包括以下步骤：

(1)取100mg新鲜铁皮石斛叶片用液氮研磨，粉末移至2mL离心管；

(2)加入2mL溶液A，轻微振荡混匀，65℃温育5 min；

(3)2000rpm离心3min，取沉淀；

(4)加入2mL溶液A，轻微振荡重悬混匀，65℃温育5 min；

(5)2000rpm离心3min，取沉淀；

(6)加入65℃预热的溶液B 1mL，65℃温育15min，取出冷却至室温；

(7)加入等体积溶液C，轻轻混匀，5000rpm离心10min；

(8)取上清，加入等体积溶液C，轻轻混匀，5000rpm离心10min；

(9)取上清，加1/10体积的溶液E，轻轻混匀，再加入等体积的溶液F，轻轻混匀；

(10) 5000rpm离心10min，弃上清；

(11) 溶液G冲洗沉淀2次，5000rpm离心5min，干燥DNA沉淀；

(12) 加入50µL溶液H溶解DNA。