[发明专利]一种稳定的蛋白质溶液、其制备方法及检测试剂盒

说明书

本发明提供一种稳定的蛋白质溶液，该蛋白质溶液包含缓冲液及含有血红素辅基的蛋白质或者含有血红素辅基的蛋白质与其他蛋白质的蛋白质缀合物，该血红素辅基中的亚铁离子与一氧化碳结合，可以防止该蛋白质或者蛋白质缀合物在储存过程中被氧化而变性，从而提高该蛋白质溶液的稳定性。该蛋白质溶液还可包含其他稳定剂。本发明的蛋白质溶液在2‑8℃下可以稳定保存至少1年，具有良好的稳定性，可以用于制备化学发光检测试剂盒或者酶联免疫检测试剂盒，例如检测胃泌素17、胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II的检测试剂盒。

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种稳定的蛋白质溶液，其中蛋白质为含有血红素辅基的蛋白质或者含有血红素辅基的蛋白质与其他蛋白质的蛋白质缀合物，本发明还涉及该蛋白质溶液的制备方法，以及包含该蛋白质溶液的检测试剂盒，例如化学发光检测试剂盒或者酶联免疫检测试剂盒。

背景技术

血红素是一些蛋白质的重要组成成分，如血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素C氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等都含有血红素，这些蛋白质在生物体内都有重要的生理功能。血红素是一个由亚铁(II)离子和原卟啉IX形成的金属卟啉配位化合物(参见以下所示的血红素结构式)。亚铁(II)离子被卟啉环的4个氮原子以配位键键合，配位数为4。

以辣根过氧化物酶(HRP)为例。HRP是一种十分常见的过氧化物酶，可以由多种来源提取得到，其催化活性中心含有一个血红素辅基结构。HRP的分子量大约在44000道尔顿左右，通常在pH＝5的条件下有最佳的催化活性。在HRP的催化反应过程中，HRP首先与过氧化物(例如过氧化氢)结合，此时HRP分子上含有亚铁卟啉结构的活性中心被氧化，生成中间体(HRP I)。该中间体与还原性底物(例如阿魏酸)反应，最终被还原为原始的HRP，完成一个反应循环(参见以下所示的HRP反应循环，其中以阿魏酸为还原性底物)。值得注意的是，过氧化氢虽然是HRP的底物，但是高浓度的过氧化氢会对HRP的活性产生抑制作用。

HRP反应循环(其中以阿魏酸为还原性底物)

HRP的用途十分广泛，可以应用于酶分析、化学发光测试、免疫测定以及废水处理等方面。HRP最常见的用途之一是免疫检测方面的应用，即可用于化学发光测定和酶联免疫吸附测定中。在制备化学发光测定以及酶联免疫吸附测定的检测试剂盒时，需要将HRP与抗体偶联，生成HRP标记抗体(即HRP-抗体结合物)，然后再将HRP标记抗体加入稀释液中配制成HRP标记抗体溶液，作为试剂盒的一部分。

在上述HRP应用中，HRP需要在不同的环境条件(例如各种体外环境)下进行催化反应，而这些环境通常不是HRP发挥其天然功能的环境。影响HRP在体外环境中发挥功能的一个主要限制因素在于其稳定性，而影响HRP的稳定性的原因一是酶蛋白三维结构不稳定，二是其血红素辅基结构中的亚铁离子易与空气中的氧气结合而被氧化，造成酶变性甚至失活。可以预见，含有血红素的蛋白质(酶)如血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素C氧化酶、过氧化氢酶以及HRP之外的过氧化物酶等也因同样的原因而存在稳定性问题，进而影响蛋白质的功能，例如酶的催化功能。

因此，如何尽可能保持含有血红素辅基的蛋白质(例如HRP)在体外环境的稳定性和催化功能，这是酶学领域一个极为重要的课题。目前已有很多用于提高稳定性的方法，例如加入抗氧化剂、蛋白质稳定剂、金属盐、碱性或中性氨基酸、多羟基化合物、多羟基聚合物来使蛋白质稳定。但是，这些方法在应用于一些需要长期保持蛋白质的高活性的场合仍然具有一定的局限。例如，市售的加入了抗体保护剂和稳定剂的HRP标记抗体稀释液一般只能使HRP标记抗体在2-8℃稳定保存半年。

发明内容

本发明的目的在于提高含有血红素辅基的蛋白质或者含有血红素辅基的蛋白质与其他蛋白质的蛋白质缀合物的溶液的稳定性，提供稳定的蛋白质溶液，并将该稳定的蛋白质溶液应用于检测试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：