[发明专利]检测沼虾杆套病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒

说明书

检测沼虾杆套病毒‑1的引物探针混合液，由引物组A和Taqman荧光探针B组成，Taqman荧光探针B的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述引物组A包含引物MrRoV‑q119F和引物MrRoV‑q119R；所述引物MrRoV‑q119F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述引物MrRoV‑q119R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述Taqman荧光探针B的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。一种沼虾杆套病毒‑1荧光定量检测试剂盒，具有所述的混合液，还具有RT‑qPCR反应液、阳性质控品和阴性质控品，所述RT‑qPCR反应液为探针法荧光定量一步法RT‑qPCR反应液，所述阴性质控品为灭菌生理盐水，所述阳性质控品是含有沼虾杆套病毒‑1复制酶基因的载体。本发明用于检测沼虾杆套病毒‑1，速度快，特异性强。

技术领域

本发明属于靶RNA片段的快速检测领域，具体地说，涉及一种检测沼虾杆套病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒。

背景技术

沼虾杆套病毒-1(Macrobrachium rosenbergii Ronivirus，MrRoV)是引起沼虾幼体期和养殖期大量死亡的致病性病毒，常引起罗氏沼虾幼体沉底、蜕皮变态缓慢，特别是幼体蜕变为仔虾过程中出现大量急性死亡，还可引起养殖期成虾鳃损伤而引起死亡，对沼虾育苗业和养殖业危害极大。MrRoV为单链RNA病毒，属于巢式病毒目(Nidovirales)杆套病毒科(Roniviridae)，现今该科下仅有一个头甲病毒属(Okavirus)，该属下仅有一个种，即对虾黄头病毒 (Yellow head virus)。沼虾杆套病毒-1于2010年从患病沼虾幼体中分离获得，之后在患病成虾中也被检出，根据流行病学调查，发现该病毒具有多个基因型，不同基因型表现不同的毒力，低毒基因型广泛流行于各大沼虾养殖场，常呈潜伏感染，在沼虾环境突变或是抗病力低下时，可引起沼虾发病死亡。但其对沼虾幼体具有高致死性，死亡率一般为60～70％，严重的达到85％以上；而对养殖大虾，引起的死亡率在10-20％左右，但累积死亡率可以达到 40％以上。该病毒近几年对沼虾产业造成的经济损失无法估量。根据发现的该病毒的基因组序列，与已报道的杆套病毒序列相似性低于40％，表明是一种新的杆套病毒。该病毒在国内外未见报道，由于该病毒至今未有检测试剂盒和检测方法，因此，本试剂盒的研制与开发，具有创新性和唯一性。该病毒检测试剂盒的开发和应用也会对该病毒引起的沼虾病害起到预警和提前防控作用。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述问题，提供了一种检测沼虾杆套病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒，本发明的引物、探针和试剂盒特异性强，敏感性高，能实现快速、有效且准确检测沼虾杆套病毒-1；本发明的试剂盒为一步法荧光定量检测试剂盒，该试剂盒可在封闭的情况下判断结果，扩增产物不会对检测环境造成污染，可用于沼虾杆套病毒-1病的监测和早期预防，也可用于无杆套病毒沼虾种虾的筛选。本发明采用荧光定量技术，通过检测沼虾杆套病毒-1的复制酶基因，来间接检测沼虾杆套病毒-1的携带情况，这是目前国内外首次研制检测沼虾杆套病毒-1的试剂盒；该试剂盒的研制为沼虾杆套病毒-1病的监测和预防奠定基础。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种检测沼虾杆套病毒-1的引物探针混合液，其特殊之处在于所述混合液由引物组A和Taqman荧光探针B 组成，探针B的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，所述引物组A和探针B是根据本发明人发现的沼虾杆套病毒-1的序列设计的。

所述引物组A包含引物MrRoV-q119F和引物MrRoV-q119R；

引物MrRoV-q119F的核苷酸序列为：

SEQ ID NO：1—5’-CTTGGAAAACCCTTACCTA-3’

引物MrRoV-q119R的核苷酸序列为：

SEQ ID NO：2—5’-GCTGAACGTTTATATATAAAGTTAG-3’